Variabilità somaclonale e
selezione di somacloni
Le piante possono essere moltiplicate
dall’uomo mediante:
• RIPRODUZIONE
SESSUALE
• RIPRODUZIONE
ASESSUALE
(propagazione
vegetativa)
Semi
• Metodi
tradizionali
(talea)
• Moltiplicazione
in vitro
Piante figlie
geneticamente diverse
tra loro e rispetto alla
pianta madre
Clone: piante figlie
geneticamente identiche
tra loro e alla pianta mare
Le piante di interesse commerciale
vengono spesso moltiplicate mediante
riproduzione asessuale …
… per far si che le piante figlie conservino i
caratteri della pianta madre e che non
emergano nuovi caratteri indesiderati
La propagazione in vitro delle piante viene
effettuata principalmente attraverso:
•ORGANOGENESI DIRETTA
Moltiplicazione di germogli
e loro radicazione
(micropropagazione)
Protoplasto
Callo buio
Callo luce
Germogli multipli
Germogli radicati
•ORGANOGENESI
INDIRETTA
Rigenerazione da cellule
indifferenziate
ORGANOGENESI INDIRETTA
Rigenerazione da callo o da protoplasti
Callo
Protoplasti
Caulogenesi (Citochinine)
Germogli multipli
Rizogenesi (Auxine)
Plantula
La plantula
rigenerata può
essere messa a
dimora se il
sistema
vascolare delle
radici è
connesso con
quello del
germoglio
ORGANOGENESI DIRETTA
Moltiplicazione di germogli
Citochinine
inibizione
dominanza
apicale
Germoglio
Germogli multipli
• Separazione dei
germogli
• Radicazione
Messa a dimora
Previa
acclimatazione
Pianta
Plantula
Spesso le piante propagate in vitro
presentano eterogeneità fenotipica
(seppure originate da espianti della medesima pianta madre!)
M.K. Biswas, M. Dutt, U.K. Roy, R. Islam, M. Hossain - Development and evaluation of in vitro somaclonal
variation in strawberry for improved horticultural traits - Scientia Horticulturae 122 (2009) 409–416
Tale fenomeno è molto più frequente (ma non esclusivo) in piante
rigenerate da cellule indifferenziate
Somacloni e variabilità somaclonale
definizione
The term ‘somaclone’ was coined to refer to plants
derived from any form of cell culture, and the term
‘somaclonal variation’ was coined to refer to the genetic
variation among such plants.
Variabilità somaclonale
Alterazioni geniche
Mutazioni puntiformi
Sostituzioni nucleotidiche
Mutazioni cromosomiche
Delezioni
Inversioni
Duplicazioni
Traslocazioni
Modificazioni genomiche
Poliploia
Aneuploidia
Modificazioni epigenetiche
Metilazione del DNA
Variabilità somaclonale
Alterazioni geniche ereditabili/non ereditabili
Mutazioni puntiformi
Mutazioni cromosomiche
Stabili
Ereditabili
Modificazioni genomiche
Modificazioni epigenetiche
Instabili
Non ereditabili
Variabilità somaclonale
Alterazioni geniche ereditabili/non ereditabili
EPIGENETIC VARIATION is often unstable and can disappear either
after plants are removed from culture or within a few clonal or
sexual generations (Kaeppler et al., 2000), while GENETIC
VARIATION is stable and then heritable (Skirvin et al., 1994).
The success in applying somaclonal variation in plant breeding is
therefore dependent on the genetic stability of the selected
somaclones.
Variabilità somaclonale
Fattori determinanti
Numerosi studi hanno evidenziato una correlazione tra
variabilità somaclonale e:
1) tipo e concentrazione di
auxine nel mezzo colturale
2) numero di subcolture
Variabilità somaclonale
Fattori determinanti
Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri
fattori possono influenzare la variabilità somaclonale:
3) Genotipo:
Le diverse varietà di una specie, sulla base del diverso
genotipo, possono essere più o meno suscettibili ai fattori
determinanti la variabilità somaclonale
Ad es., alcune varietà possono avere sistemi di prevenzione
delle mutazioni e riparazione del DNA più efficaci rispetto
ad altri individui della stessa specie
Variabilità somaclonale
Fattori determinanti
Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri
fattori possono influenzare la variabilità somaclonale:
4) Tipo di espianto:
Diversi tipi di espianto, seppure ottenuti dal medesimo
individuo, possono originare diversi gradi di variabilità
somaclonale
In genere, più giovani sono gli espianti e minore è
l’incidenza della variabilità somaclonale (i tessuti più
maturi sono mosaici di mutanti mitotici)
Variabilità somaclonale
Fattori determinanti
Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri
fattori possono influenzare la variabilità somaclonale:
5) Substrato
Per motivi ad oggi ignoti, la frequenza della variabilità
somaclonale può essere diversa in colture mantenute su
mezzi colturali di diversa composizione
Le principali differenze tra mezzi colturali sono: micro- e
macro-nutrienti, vitamine, chelanti del Fe e tamponi
Variabilità somaclonale
Fattori determinanti
Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri
fattori possono influenzare la variabilità somaclonale:
6) Condizioni colturali
Anche le condizioni colturali, principalmente illuminazione,
temperatura e umidità, possono incidere sul grado di
variabilità somaclonale
In generale, più sono stressanti le condizioni di crescita,
maggiore è la probabilità di insorgenza di variazioni
somaclonali
Variabilità somaclonale
Potenzialità
La variabilità somaclonale può rappresentare un
problema per la propagazione di genotipi di elezione …
… tuttavia, può anche rappresentare un vantaggio per
alcune applicazioni:
Selezione di somacloni iperproducenti composti di interesse
industriale
Selezione di somacloni resistenti a composti chimici (alluminio, NaCl)
Selezione di somacloni resistenti a stress biotici o abiotici (funghi,
siccità, insetti)
Variabilità somaclonale
Valutazione
Il grado di variazione somaclonale viene valutato sulla
base di diversi parametri:
fenotipici (altezza pianta,
resistenza a stress)
SELEZIONE VISIVA
(visual screening)
biochimici (analisi delle
proteine, formazione di
metaboliti secondari)
ANALISI CHIMICHE
genetici (analisi del
cariotipo, analisi con
marcatori molecolari, grado
di metilazione DNA)
ANALISI
CITOGENETICHE E
BIOMOLECOLARI
Variabilità somaclonale
In vitro ed ex vitro
IN VITRO: sulle masse cellulari indifferenziate (ad es.
produzione di pigmenti)
EX VITRO: sulle piante rigenerate (caratteri morfologici o
fisiologici)
Variabilità somaclonale
Valutazione con markers molecolari
Una delle tecniche più diffuse è:
RAPD
Randomly
Amplified
Polymorphic
DNA
Variabilità somaclonale
RAPD test
Principale vantaggio: può essere effettuato su piante con
genoma parzialmente o totalmente ignoto
È una PCR in cui, invece di primers disegnati
appositamente sulle sequenze target, si usano primers
casuali (random primers) di piccole dimensioni (8-12 bp)
Variabilità somaclonale
RAPD test
1. Estrazione del DNA
2. Amplificazione del DNA mediante PCR con random
primers
3. Separazione elettoforetica su gel di agarosio
4. Confronto tra gli ampliconi ottenuti da diversi
somacloni
5. Analisi statistica dei dati ottenuti
Variabilità somaclonale
Problemi
Non sempre la selezione dei somacloni è un metodo
adeguato all’ottenimento di nuove varietà vegetali:
Dipendenza dal genotipo
Variazioni instabili e non ereditabili
I caratteri di interesse possono non essere modificati
Molti cambiamenti sono indesiderati
Incontrollabile e non prevedibile
Estrazione di metaboliti vegetali e
loro identificazione/quantificazione
mediante HPLC
Estrazione
Solubilizzazione dei metaboliti
La gran parte delle metodiche per l’analisi dei metaboliti
vegetali richiedono che essi siano:
• in fase liquida (es. HPLC e NMR)
• in fase gassosa (es. GC)
Il materiale vegetale non può essere analizzato tal quale
Estrazione in fase liquida
Matice fresca e secca
L’estrazione dei metaboliti può essere effettuata su:
-Biomassa vegetale fresca (idratata)
-Biomassa vegetale secca (disidratata)
Essiccazione
Estrazione
Essiccazione
L’essiccazione viene generalmente effettuata in stufa ad alte
temperature e per tempi lunghi (per es. foglie 70°C per 72 h)
Inadatta per metaboliti termolabili, che devono essere estratti da
biomassa fresca o essiccata in liofilizzatore
Stufa da laboratorio
Liofilizzatore da bancone
Estrazione
Triturazione
L’efficienza dell’estrazione è tanto maggiore quanto più è ampia la
superficie di contatto tra matrice vegetale e solvente
Triturazione del materiale vegetale
Triturazione di foglie secche con pestello e mortaio
Estrazione
Polverizzazione
Esistono metodiche che permettono di ottenere polveri finissime,
con enormi incrementi della superficie di contatto matrice/solvente
Polverizzazione in N2 liquido (-196 °C)
A
B
C
D
Polverizzazione in N2 liquido di radici coltivate in vitro
Estrazione
Omogeneizzazione
Esistono strumenti che permettono di ridurre la matrice vegetale in
piccolissimi frammenti direttamente nel solvente di estrazione
Omogeneizzatori a immersione
Ultraturrax
Estrazione
Sonicazione
È possibile incrementare la permeabilità delle membrane
biologiche, aumentando di molto l’efficienza dell’estrazione
Sonicazione
Bagno a ultrasuoni
Estrazione
Estratti totali
Spesso gli estratti totali vengono ottenuti con solventi a polarità
media
Estratti etanolici e metanolici
Matrice vegetale
Estrazione con
MeOH o EtOH
Estratto totale
L’estratto così ottenuto è molto complesso, cioè composto da un
numero elevatissimo di metaboliti
Estrazione
Estratti totali
È possibile ottenere estratti totali più semplici (minor numero di
metaboliti) e quindi più facili da analizzare
Estrazioni seriali con solventi a polarità crescente
Matrice vegetale
Estatto 3
Estrazione con
cloroformio
(CHCl3)
Estrazione con
metanolo
(MeOH)
Estratto 1
Estrazione con
acetato di etile
(EtOAc)
Estratto 2
Frazionamento
Colonne cromatografiche
Diversi metodi permettono di ottenere dagli estratti totali delle
frazioni, ciascuna contenente un numero limitato di metaboliti
Separazione cromatografica
Evaporazione
Evaporazione del solvente
Spesso i metaboliti contenuti negli estratti e nelle frazioni sono
troppo diluiti per essere analizzati
L’estratto deve essere portato a secco e poi risolubilizzato in un
piccolo volume di solvente
Evaporatore rotante (rotavapor)
Analisi HPLC
Separazione, identificazione e quantificazione
L’HPLC è una delle metodiche più usate per l’analisi dei metaboliti
contenuti in estratti e frazioni
High Performance Liquid Chromatography
High Pressure Liquid Chromatography
Analisi HPLC
Principi generali
Un piccolissimo volume di estratto viene iniettato nel sistema HPLC
attraverso l’iniettore
Hamilton
Iniettore
Analisi HPLC
Principi generali
L’estratto raggiunge la colonna cromatografica attraverso un piccolo
tubo, sospinto da una soluzione sotto pressione (eluente)
Eluente
L’eluente costituisce la FASE MOBILE del sistema
Analisi HPLC
Principi generali
All’interno della colonna si trova un materiale granulare nei cui
interstizi (pori) la fase mobile può fluire
colonne
Il materiale interno alla colonna costituisce la FASE STAZIONARIA
Analisi HPLC
Principi generali
Le diverse molecole presenti nell’estratto procederanno a diversa
velocità nella colonna …
Separazione
… sulla base della loro affinità con la fase fissa e con la fase mobile:
SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA
Analisi HPLC
Principi generali
Ciascuna sostanza raggiungerà il detector dopo un certo tempo
dall’iniezione (tempo di ritenzione)
Detector
Nel detector viene misurata l’assorbanza della sostanza ad una o
più lunghezze d’onda
Analisi HPLC
Principi generali
Il detector restituisce un profilo cromatografico in cui a ciascun
picco corrisponde una determinata sostanza
Tempo di ritenzione
L’area sottesa al picco è proporzionale alla concentrazione della
sostanza
Analisi HPLC
Analisi di metaboliti noti
Per l’identificazione e per la quantificazione degli analiti sono
necessari gli standard, ossia campioni puri dell’analita
L’HPLC non è adatta alla caratterizzazione strutturale di composti
ignoti, poiché richiede la disponibilità di standard
Per la gran parte dei metaboliti noti sono disponibili in commercio
gli standard, cioè campioni puri degli analiti
Uso degli standard
Determinazione del tempo di ritenzione
L’attribuzione di un è effettuata sulla base dell’identità con il tempo
di ritenzione dello standard
Standard
Sorbate
Caffeine
Benzoate
Energy Drink
Uso degli standard
Determinazione del tempo di ritenzione
Con soluzioni a diversa concentrazione di standard viene costruita
una retta di taratura e viene determinata l’equazione della retta
Mediante l’equazione della retta è possibile calcolare la
concentrazione dell’analita nell’estratto
