dna ricombinante e biotecnologie

DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE
TAGLIO E RICUCITURA DEL DNA
Ogni enzima di restrizione ha uno specifico sito di restrizione. Es. EcoRI taglia il DNA nei punti in
cui incontra la sequenza 5’… GAATTC …3’leggendo nella direzione 5’…3’
3’…CTTAAG …5’
Esistono centinaia di enzimi di restrizione. Mediamente ogni frammento è costituito da 4000 coppie
di basi.
E’ possibile produrre DNA ricombinante in provetta:
Molti enzimi di restrizione non producono estremità appiccicose ma estremità piatte perché tagliano
entrambi i filamenti a livello della stessa coppia di basi.
I geni possono essere clonati in cellule procariotiche o eucaristiche. I batteri mancano però del
complesso di taglio e cucitura che provvede ad eliminare gli introni quindi male si prestano per
clonare geni eucarioti. Le proteine eucariote vengono poi estesamente modificate dopo la sintesi.
Ottimi organismi eucarioti: lieviti e piante (totipotenti).
I vettori possono trasportare nuovo DNA nella cellula ospite.
Un vettore deve possedere quattro caratteristiche:
1. deve replicarsi in modo indipendente nella cellula ospite (il nuovo DNA deve contenere
un’origine della replicazione deve costituire cioè un replicone o unità replicativa);
2. una sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione grazie al quale il vettore sia
tagliato e combinato col nuovo DNA.
3. un gene reporter che ne segnali la presenza nella cellula ospite;
4. piccole dimensioni rispetto a quelle dei cromosomi della cellula, che ne facilitano
l’isolamento
 I plasmidi presentano tutti i requisiti sopra indicati e possono replicarsi indipendentemente
dal cromosoma batterico (centinaia di copie di plasmidi).
 I virus procariotici ed eucariotici hanno il vantaggio, rispetto ai plasmidi, di veicolari
frammenti di DNA di maggiori dimensioni ed infettano naturalmente le cellule ospiti senza
eccessive manipolazioni genetiche.
 Per manipolare i lieviti (eucarioti) non si possono utilizzare i plasmidi (procarioti) a causa di
differenti origini di replicazione, ma si crea un cromosoma minimo detto cromosoma
artificiale di lievito o YAC. Questi cromosomi possono avere dimensioni consistenti (fino a
1,5 milioni di coppie di basi)
 Agrobacterium tumefaciens. Plasmide Ti che contiene DNA T (trasposone).
Marcatori genetici permettono di identificare le cellule ospiti trasfettate con DNA ricombinante
(geni reporter): geni per la resistenza agli antibiotici, operone lac, gene per la luciferasi, ecc.
Provenienza dei geni utilizzati negli esperimenti di clonazione.
Librerie gnomiche, cDNA, DNA sintetico
Un insieme di molecole di cDNA ottenute dall’mRNA espresso in un determinato momento in un
particolare tessuto è detto libreria di cDNA.
Le librerie di cDNA sono utili per il confronto dell’espressione dei geni in differenti tessuti a
differenti stadi di sviluppo. Il cDNA è anche utile per la clonazione di geni eucarioti presenti in
poche copie nel genoma.
Conoscendo la sequenza amminoacidica di una proteina è possibile ottenere un DNA che codifica
tale proteina semplicemente sintetizzandolo in laboratorio con le tecniche della chimica organica. Si
aggiungono anche i codoni per l’inizio, la terminazione e la regolazione della trascrizione.
E’ possibile introdurre nel DNA mutazioni mirate e studiare le relazioni causa-effetto (es. codoni
sequenza segnale).
ALTRI STRUMENTI UTILIZZATI NEGLI ESPERIMENTI DI MANIPOLAZIONE DEL DNA.
I geni possono essere inattivati per ricombinazione omologa
I chip di DNA possono rivelare le mutazioni del DNA e l’espressione dell’RNA
La lastra è divisa in quadrati di 24 X 24
micrometri. Ciascuno dei quali contiene circa
10 milioni di copie ognuna lunga fino a 20
nucleotidi. Su tale chip sono contenute fino a
60000 sequenze diverse.
Se si utilizza m-RNA si usa la tecnica RTPCR.
In tal modo è possibile individuare quadri
di espressione genica di tessuti in differenti
fasi di sviluppo o per individuare
specifiche mutazioni in un determinato
individuo.
Gli RNA antisenso e di interferenza possono impedire l’espressione di specifici geni
Il sistema a due ibridi mostra quali proteine interagiscono in una cellula.
Il fattore di trascrizione ha due domini (due componenti proteiche) che sono separati in due
differenti plasmidi ricombinanti.
Sistema a due ibridi del lievito
Per verificare se due proteine interagiscono a livello
cellulare si può sfruttare la presenza di un
determinato gene reporter. Il gene reporter viene
infatti attivato da determinati fattori di trascrizione
che sono di natura proteica. Si possono pertanto
utilizzare due differenti plasmidi vettori codificanti,
ciascuno, anche per una proteina bersaglio. Il
legame eventuale delle due proteine attiverà il fattore
di trascrizione così completo ed il gene reporter
verrà trascritto.
I VETTORI DI ESPRESSIONE POSSONO TRASFORMARE LE CELLULE IN FABBRICHE DI
PROTEINE
Il vettore di espressione che inserisce un gene eucariote
in un batterio deve contenere un promotore batterico
per il legame dell’RNA polimerasi batterica, gli
elementi di terminazione della trascrizione e una
speciale sequenza che permette all’mRNA di legarsi
al ribosoma.
Nel caso di cellule eucariote devono essere inclusi anche
il sito per la sequenza di poli-A, i siti dei fattori di
trascrizione e gli intensificatori (enhancers)
Può essere introdotto un promotore inducibile, un
promotore tessuto-specifico e sequenze di indirizzo.
CON LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE E’ POSSIBILE OTTENERE PROTEINE
DI IMPORTANZA MEDICA.
Nel sangue dei mammiferi è presente un enzima, la
plasmina, che catalizza la dissoluzione dei coaguli. Tale
enzima è tuttavia presente in una forma inattiva: il
plasminogeno. La trasformazione del plasminogeno in
plasmina avviene ad opera di un altro enzima l’Attivatore
Tissutale del Plasminogeno (TPA) prodotto dalle cellule che
rivestono i vasi sanguigni.
Anche un enzima batterico, la streptocinasi, stimola la
rapida dissoluzione dei coaguli nei pazienti ma presenta
effetti collaterali seri (reazioni immunitarie, impedimento
della coagulazione).
La tecnologia del DNA-ricombinante ha risolto il problema
PIANTE CHE SINTETIZZANO I PROPRI INSETTICIDI (B. thuringiensis – geni per le tossine
isolati e introdotti tramite plasmidi Ti – pomodori, granoturco, patate, cotone transgenici )
ANIMALI TRANSGENICI ESPRIMONO GENI UTILI (un tipo di enfisema è causato dalla
carente presenza di una proteina (alfa1-antitripsina) che inibisce l’elastasi, un enzima che rompe il
tessuto connettivo. Il gene relativo per tale proteina è stato inserito in cellule uovo di pecora accanto
al promotore per la lattoglobulina). Pharming.
PIANTE DA RACCOLTO RESISTENTI AGLI ERBICIDI (resistenza al glifosato indotta in
cotone e soia utilizzando un gene isolato da batteri del terreno. )
GRANAGLIE CON MIGLIORI CARATTERISTICHE NUTRIZIONALI (il riso contiene un
precursore molecolare del beta-carotene che l’organismo converte in vitamina A. Il batterio Erwinia
e le piante di narciso selvatico dispongono di enzimi in grado di convertire il precursone in betacarotene)
CEREALI CHE SI ADATTANO ALL’AMBIENTE (resistenza del pomodoro ai terreni salsi grazie
ad un gene ricavato da Arabidopsis thaliana)
IMPRONTA GENETICA E PCR
(Variable Number Tandem
Repeats)