Parametri fondamentali della microscopia
La proprietà fondamentale di un microscopio è la possibilità di
ottenere un’immagine ingrandita di un oggetto.
L’ingrandimento fornito da uno strumento ottico è definito come il
rapporto tra:
L’angolo sotto cui si vede un oggetto con lo strumento e
l’angolo sotto cui si vede lo stesso oggetto senza strumento .
Il rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio e
quella dell’oggetto.
40°
10°
Parametri fondamentali della microscopia
L’ingrandimento da solo non basta, è necessaria la capacità di
distinguere i particolari: risoluzione
Parametri fondamentali della microscopia
Potere di risoluzione
Il potere di risoluzione di un sistema ottico consiste nella capacità di
distinguere due punti dell’oggetto che stiamo osservando come due
punti distinti fra di loro.
L’occhio umano ha un PdR = 0,1 mm
Il microscopio ottico ha un PdR = 0,2 μm
R = 0,61 λ / AN
dove R = distanza minima fra due punti che il sistema ottico è in grado di risolvere, λ = lunghezza d’onda del
sistema di illuminazione impiegato, ed A N = apertura numerica dell’obiettivo.
AN = n senα
dove n=indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente ed oggetto; α = l’angolo di accettazione della luce
della lente frontale dell’obiettivo
Anatomia di un microscopio
fotocamera o
telecamera
oculari
stativo
vite macrometrica
e micrometrica
revolver con
obiettivi
tavolino
traslatore
IL MICROSCOPIO OTTICO
Due lenti convergenti principali
(in realtà sistemi ottici):
¾ obiettivo → forma un’immagine reale
ingrandita dell’oggetto
¾
oculare → forma un’immagine virtuale
ulteriormente ingrandita
L’obiettivo è rappresentato da un doppio
sistema di lenti convergenti che proietta
l’immagine ingrandita ed invertita dell’oggetto
sotto osservazione all’oculare in modo che
questo possa "vederla" ed ingrandirla
ulteriormente. La distanza della lente frontale
dell’obiettivo dal campione è piuttosto piccola
variando da 30 mm a 0,1 mm a seconda del
suo potere di ingrandimento, in maniera
inversamente proporzionale: maggiore è il
potere di ingrandimento minore è la distanza
di lavoro dell’obiettivo.
Il
revolver degli obiettivi è rotante e consta generalmente di 4
obiettivi ad ingrandimento crescente (4x, 10x, 40x e 100x).
Col microscopio ottico si possono ottenere fino a 1000
ingrandimenti.
Il binoculare dà un ingrandimento di 10 volte (10x), ed è dotato di un
dispositivo di allargamento-restringimento della distanza dei due oculari.
L’ingrandimento finale è dato dalla moltiplicazione dell’ ingrandimento
dell’obiettivo con quello dell’oculare.
Anatomia di un microscopio
fotocamera o
telecamera
fonte di
illuminazione
condensatore
diaframma
di campo
I campioni da esaminare al microscopio ottico devono essere
illuminati perché si possa formare una loro immagine visibile
nell’oculare e, di solito, questo viene ottenuto con "luce trasmessa",
ovvero la luce attraversa i campioni stessi. Il condensatore è un
sistema di lenti posto al di sotto del tavolino traslatore del
microscopio ed è provvisto di un "diaframma di apertura" che
permette di modificare l’ampiezza del cono di luce che da esso esce,
adattandolo alla AN dell’obiettivo in uso
lente del condensatore → focalizza la luce incidente sul campione
diaframma → regola l’intensità luminosa
La
fonte di illuminazione è una radiazione con lunghezza d’onda
relativamente lunga (visibile 400-700 nm)
Indagine Istologica
Ematossilina-Eosina: l'ematossilina colora i nuclei di violablu, mentre l'eosina colora di rosa il citoplasma, il connettivo e
le sostanze intercellulari.
La colorazione tricromica di Mallory viene fatta usando tre coloranti:
la fucsina acida che tinge in rosso i nuclei
l'azzurro di anilina che conferisce al connettivo collageno una tonalità
azzurra
l'orange G che colora i citoplasmi in arancione.
Indagine Istochimica
Cerca di localizzare al microscopio ottico la presenza di
determinate sostanze chimiche all’interno della cellula.
I componenti della cellula che si possono identificare sono:
acidi nucleici
proteine
lipidi
polisaccaridi
Reazione istochimica utilizzata per evidenziare il DNA:
Reazione di Feulgen
Sudan nero
Rosso Congo
Reazione istochimica utilizzata per evidenziare i carboidrati
PAS
I granuli di glicogeno presenti negli
epatociti
Lobo epatico
Reazione istochimica utilizzata per evidenziare le proteine
in generale: Blu di Bromofenolo
IMMUNOISTOCHIMICA
LA SEZIONE ISTOLOGICA VIENE FATTA REAGIRE DAPPRIMA CON
L’ANTICORPO CHE SI COMBINA DIRETTAMENTE CON IL SUO Ag (AbI)
FORMANDO IL COMPLESSO PRIMARIO
=
+
Ag
AbI
Complesso primarioAgAg AbI
SUCCESSIVAMENTE L’ANTICORPO SECONDARIO MARCATO (AbII)
AbII VIENE
INCUBATO SULLA SEZIONE CONTENENTE IL COMPLESSO PRIMARIO. L’AbII SI
COMBINA CON IL SUO ANTIGENE (AbI)
AbI RILEVANDONE LA LOCALIZZAZIONE
=
+
AbII
Complesso
primarioAgAg AbI
Complesso
secondario
•
Enzimi coniugati (perossidasi, fosfatasi alcalina,
ß galattosidasi )
Microscopio a fluorescenza
La fluorescenza e` il fenomeno per cui alcune sostanze
fluorescenti colpite da tale radiazioni emettono luce di λ
maggiore e dunque visibili.
Il preparato è legato a fluorocromi, molecole in grado di
emettere luce di una specifica lunghezza d'onda (quindi
di un unico colore) quando eccitati con luce di una
lunghezza d'onda inferiore
La sorgente luminosa e` una lampada a vapori di
mercurio che emette radiazioni invisibili (ultravioletto,
200-400nm).
•
Fluorocromi ( isotiocianato di fluoresceina,
rodamina, ficoeritrina…)
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il microscopio elettronico utilizza un fascio di
elettroni e non di fotoni, come un microscopio
ottico, poiché i fotoni che compongono un raggio di
luce posseggono un lunghezza d´onda molto
maggiore degli elettroni: dato che il potere di
risoluzione di un microscopio è inversamente
proporzionale alla lunghezza d´onda della
radiazione che utilizza, usando elettroni si raggiunge
una risoluzione parecchi ordini di grandezza
superiore.
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima
foto al micr. Elettronico (17.400 X)
1939: TEM disponibile sul mercato
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla
topografia della superficie di un campione colpito da un fascio di
elettroni. Basi per la costruzione del primo Microscopio Elettronico
a Scansione (SEM).
1938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumento
1965 il SEM diventa commercialmente disponibile
IL MICROSCOPIO ELETTRONICO
A trasmissione (TEM): gli elettroni attraversano il preparato
A scansione (SEM): gli elettroni incidono sulla materia,
determinando l'emissione di elettroni secondari che, raccolti,
forniscono immagini dettagliate della superficie degli oggetti dei
quali
risulta
una
visione
tridimensionale.
TEM
filamento
(catodo)
anodo
condensatore
preparato
obiettivo
proiettore
schermo
• La sorgente luminosa è sostituita da un
fascio di elettroni accelerati nel vuoto.
• Le lenti sono sostituite da campi magnetici
ed elettrici che hanno un effetto convergente
sugli elettroni. Gli elettroni si associano ad
una lunghezza d'onda molto più piccola
rispetto a quella dello spettro visibile; ciò
determina un aumento del potere risolvente
fino a circa 10 Å.
• L'immagine fornita è invisibile all'occhio
umano, ma può essere fotografata e raccolta
su uno schermo fluorescente che emette luce
visibile sotto l'urto degli elettroni
provenienti dal preparato; essa risulta in
bianco e nero con varie tonalità di grigio in
corrispondenza della maggiore o minore
trasparenza agli elettroni delle strutture
cellulari.
Esempio di microfotografia elettronica al T.E.M.
S.E.M
Ingrandimento :
da 10 a 200000 volte
• Un fascio di elettroni primari, focalizzato da
lenti elettroniche, viene inviato sul campione
muovendolo, con un sistema generatore di
scansione, così da farlo scorrere sulla superficie
dell'oggetto in esame. Il fascio di elettroni
durante la scansione del campione colpisce la
sua superficie generando degli elettroni
secondari.
• La quantità e l'energia degli elettroni secondari
retrodiffusi da ogni punto del campione colpito
dal fascio elettronico dipendono dalla
morfologia, oltre che dalla natura chimica, del
campione in quel punto.
• Un rivelatore di elettroni secondari retrodiffusi
provvede a raccogliere il segnale che viene
acquisito da un sistema di generazione
dell'immagine ed inviato su uno schermo,
ove
viene così tracciata l'immagine del
campione esaminato.
Potere di risoluzione: 200 Angstrom
Esempio di microfotografia elettronica al S.E.M.
Fasi principali della preparazione di campioni per la
Microscopia Elettronica a Trasmissione
1)
1) Prelievo
Prelievo
Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni
richieste per attuare un’adeguata fissazione, disidratazione
ed inclusione in resina
2) Fissazione
Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e
macromolecolari dell’architettura cellulare, provocando l’arresto
istantaneo di tutte le attività chimico-fisiche cellulari
Fissativo di Karnovsky:
paraformaldeide 8%, gluteraldeide 50%, tampone fosfato 0.1M
I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone.
Principali tamponi:
a) Tampone fosfato (+ usato);
b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato);
c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)
2a) Post-Fissazione in Tetrossido di
Osmio
3) Disidratazione
Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel
campione, per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione
Passaggi:
Etanolo 50% 10min
“
70% 10min
“
85% 10min
“
90% 10min
“
95% 10min
“ 100% 2x20min
4) Trattamento con ossido di propilene
ed Inclusione in resina Epon 812
La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il
campione in fettine sottili.
Si effettua una serie di passaggi in una miscela di ossido
di propilene e resina epossidica per favorire la successiva
impregnazione nella resina assoluta.
Il trattamento in stufa a 60 °C per almeno due giorni
consente la polimerizzazione della resina.
5) Taglio con ultramicrotomo
6) Contrasto delle sezioni ultrasottili
Sezioni ultrasottili 60-80nm vengono
tagliate con lame di diamante e poste su
retini. In seguito vengono contrastate
con acetato di uranile e citrato di
piombo e osservate al microscopio
elettronico. Le sezioni di tessuto devono
essere sottilissime per consentire il
passaggio degli elettroni il cui potere di
penetrazione è molto basso.
