Malattie trasmissibili emergenti in maricoltura: la vibriosi sostenuta da Vibrio harveyi
APPROCCIO POLIFASICO ALL’IDENTIFICAZIONE DI VIBRIO HARVEYI:
FENOTIPICO, GENETICO E PROTEOMICO
Dottorato in Scienze Veterinarie
XXIX Ciclo
Tobia Pretto, Amedeo Manfrin1, Marialetizia Fioravanti2
1IZS
delle Venezie – CSI – Adria (RO)
2Dip. Scienze Mediche Veterinarie - Alma Mater Studiorum, Università di Bologna
INTRODUZIONE:
Vibrio harveyi è una specie patogena emergente per l’acquacoltura marina a livello globale. Riconosciuto da lungo tempo come causa di infezioni nei gamberi peneidi, sta
recentemente acquisendo importanza anche in specie ittiche quali: cernie, squali, barramundi, pesci piatti e branzino. In Dicentrarchus labrax V. harveyi è stato isolato in
episodi di mortalità, durante le fasi di ingrasso (40-160 gr) e caratterizzati da atassia natatoria, anoressia, lesioni cutanee e cheratiti.
41 ceppi identificati biochimicamente come V. harveyi, appartenenti alla ceppoteca del dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie (Università di Bologna) e del Centro
Specialistico Ittico (IZS delle Venezie), isolati in branzino a partire dal 2008 da 12 impianti di allevamento italiani (gabbie a mare e vasche a terra), sono stati sottoposti ad
analisi comparative fenotipiche, genetiche e del profilo proteico. La capacità discriminante dei vari metodi è stata valutata raffrontando questi ceppi di campo con ceppi di
referenza di V. harveyi e di Vibrionaceae filogeneticamente prossime a Vibrio harveyi (Harveyi clade, Sawabe et al., 2007) quali V. rotiferianus, V. owensii, V. campbelli, V.
alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. natriegens, V. mytili. Sono state inoltre comparate specie causa di patologia in branzino (Photobacterium damselae piscicida, P.
damselae damselae , V. anguillarum, V. ordalii, V. scophthalmi) e specie isolate in ambiente marino con caratteristiche fenotipiche simili (V. vulnificus, V. gigantis, V. xuii).
MATERIALI E METODI
FENOTIPO:
GENOTIPO:
PROFILO PROTEICO:
Dopo la rivitalizzazione dei ceppi in TSB 2%NaCl e
successiva crescita clonale in BA e TSA 2%NaCl è stata
valutata la morfologia e sono stati eseguiti test KOH,
ossidasi, catalasi, sensibilità a O/129 e luminescenza.
In seguito si è proceduto con prove biochimiche in
macrometodo (O-F, SIM, KIA), crescita su terreni
differenziali e selettivi (TCBS, CHROMagar™ Vibrio,
MacConkey Agar) e prova in micrometodo con
inoculo al 2% NaCl (API 20E, bioMérieux). Tutte le
prove sono state valutate a 25°C. I dati fenotipici
ottenuti (28 parametri) sono stati elaborati mediante
il programma R (coefficiente di Gower) per ottenere
un dendrogramma di clusterizzazione gerarchica
Da colonie di 18-24 h il DNA è stato estratto mediante
kit commerciale (QIAamp® DNA mini Kit, QIAGEN).
L’analisi dei differenti ceppi è stata condotta mediante
il sequenziamento e l’analisi filogenetica del gene
uridina monofosfato chinasi, PyrH (Tall et al., 2013),
comparando le sequenze ottenute con i dati presenti
nel database Genebank di ceppi di referenza, ove
possibile. Successivamente è stata ottimizzata una
PCR-end point specie-specifica (amplificazione del
gene toxR secondo Pang et al., 2006) e gli amplificati di
tutti i ceppi sono stati valutati mediante elettroforesi in
gel di agarosio (banda attesa di 382 bp).
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)
La metodica in spettrometria di massa MALDI-TOF ha
analizzato il contenuto proteico ribosomiale di
colonie di 24 h. Tutti gli estratti sono stati testati in
duplicato mediante MaldiBiotyper (BrukerDaltonics).
Gli spettri MSP ottenuti dai ceppi in esame sono stati
comparati con il database BrukerDaltonics (5627
spettri) implementato con spettri di ceppi Vibrio spp.
di referenza standardizzati in precedenza (93 ceppi).
L’identificazione dei ceppi è stata considerata
accurata a livello di specie con uno score > 2,0.
Phot. damsela piscicida
Phot. damsela damsela
Phot. damsela damsela
Vibrio vulnificus
Vibrio mytili
Figura 1: Analisi filogenetica basata sul gene PyrH (Neighbour joining, bootstrap = 1000).
Figura 2: Dendrogramma basato su 28 parametri fenotipici di 41 ceppi di campo e 19 ceppi di referenza (UPMGA
I ceppi di referenza e di campo analizzati in questo studio sono contrassegnati con simbolo
clustering, indice cofenetico 0,97). Il riquadro demarcato in rosso evidenzia il cluster genetico Vibrio harveyi, i simboli
richiamano i codici identificativi in Fig. 1.
RISULTATI:
FENOTIPO: sono risultate discriminanti le prove in micrometodo di metabolismo degli amminoacidi:
arginina deidrolasi (ADH), lisina decarbossilasi (LDC), ornitina decarbossilasi (ODC), e del citrato (CIT)
associate alla colorazione di CHROMagar™ Vibrio a 48 h e TCBS.
Il profilo caratteristico per V. harveyi è : ADH -,LDC +, ODC +, CIT +, TCBS giallo, CHROMagar bicolore,
lilla o rosa tenue dove le colonie sono più fitte e bianco latte dove sono disseminate. La luminescenza
è stata osservata solo nel 20% dei ceppi analizzati. Sono stati riscontrati ceppi di V. harveyi con
variazioni nel fenotipo: TCBS verde (2%), ODC - (7%), e CHROMagar monocolore bianco (14%). L’analisi
dei dati fenotipici ha permesso una clusterizzazione efficace dei ceppi di campo con i due ceppi V.
harveyi di referenza (Fig. 2); un solo ceppo di campo non saccarolitico è stato escluso.
GENOTIPO: le sequenze del gene PyrH dei ceppi analizzati permettono una clusterizzazione coerente
nella totalità dei casi con le sequenze in letteratura (Fig. 1). L’analisi del gene toxR specie-specifico ha
amplificato tutti i ceppi di V. harveyi di campo e di referenza con una banda di circa 380 bp come
riportato in bibliografia; un numero limitato di altri Vibrio (V. rotiferianus, V. campbellii, V. gigantis) ha
amplificato bande chiaramente differenziabili per bp da V. harveyi.
PROFILO PROTEICO: l’esito del MALDI-TOF ha rispecchiato l’assegnazione di specie ottenuta dal
genotipo. 40 ceppi di campo sono stati assegnati con I e II best match a V. harveyi (score > 2,3), un
solo ceppo di campo ha presentato I best match con V. diabolicus e II match con V. harveyi.
Vibrio harveyi : colorazione di CHROMagar™ Vibrio (post 48 h)
e profilo API 20E post 24 h
DISCUSSIONE:
Le analisi sin qui condotte hanno evidenziato un’ottima concordanza
nell’identificazione di ceppi di V. harveyi. L’analisi del gene toxR
appare promettente, per rapidità e costo, rispetto al sequenziamento
del gene PyrH. L’identificazione mediante MALDI-TOF appare rapida
ed efficiente, grazie all’implementazione preliminare del database
BrukerDaltonics con ceppi di Vibrio spp. Le prove fenotipiche sono
state complessivamente in grado di discriminare V. harveyi dai
congeneri, tuttavia dai dati in bibliografia si riscontra una certa
variabilità nei risultati biochimici per le prove ritenute discriminanti.
Appare pertanto necessario analizzare un maggior numero di ceppi,
della medesima specie, di Vibrio appartenenti al clade Harveyi.
ATTIVITÀ PREVISTE PER IL II ANNO
Implementazione data set, valutazione dei fattori di virulenza, prova di infezione
sperimentale con differenti ceppi di V. harveyi in D. labrax.
