pisa2014 andreotti_cubellis

DIAGNOSI MOLECOLARE DI UNA
MALATTIA GENETICA E
SVILUPPO DI UNA TERAPIA
GIUSEPPINA ANDREOTTI
M.VITTORIA CUBELLIS
PREMESSA
Tutte le informazioni presenti in questa
presentazione non sostituiscono in
alcun modo il giudizio di un medico
specialista, l'unico autorizzato ad
effettuare una consulenza medica ed
esprimere un parere medico.
MALATTIA DI FABRY
SINTOMI, ETA’ DI INSORGENZA E GRAVITA’ VARIABILI
DAI SEGNI CLINICI ALLA DIAGNOSI MOLECOLARE
atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctgggg
ctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagcgcttcatgtgcaaccttgactgcc
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gaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaa
aagacttactttaaaa
USCITE DALLA MODALITA’
SCHERMO INTERO E
COPIATE LA SEQUENZA
Ricordiamo?
il DNA …..
ANALIZZEREMO
IL DNA DI UN PAZIENTE
PER
IDENTIFICARE DELLE DIFFERENZE RISPETTO AI SANI
UTILIZZEREMO
IL
PROGRAMMA BLAST
E
UNA
BANCA DATI CHE CONSERVA LE SEQUENZE DEL
DNA UMANO DI RIFERIMENTO
UNA BANCA DATI DI SEQUENZE E’ UNA COLLEZIONE DI FILE COME QUELLO CHE
VEDRETE ANDANDO AL LINK.
OGNI FILE CONTIENE:
•
LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DI UN GENE O DI UN RNA, SE SI TRATTA DI UNA BANCA
DATI NUCLEOTIDICA
•
LA SEQUENZA DI UNA PROTEINA, SE SI TRATTA DI UNA BANCA DATI DI PROTEINE
VOGLIAMO
CONFRONTARE
LA SEQUENZA DEL DNA DEL
PAZIENTE
CON
OGNUNA
DELLE SEQUENZE PRESENTI
NELLA BANCA DATI.
ANCHE LIMITANDOCI ALLE
SEQUENZE UMANE, QUESTO
E’ IMPOSSIBILE DA FARE
SENZA
L’AIUTO
DI
UN
PROGRAMMA
IL
PROGRAMMA
SI
CHIAMA
BLAST (NUCLEOTIDE)
NELLA PAGINA INSERIREMO LA
SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL
PAZIENTE
COME
SCEGLIEREMO
ORGANISMO
SAPIENS”
poi
E
“HOMO
L’OUTPUT DEL PROGRAMMA CI DICE CHE IL FRAMMENTO DI DNA CHE STIAMO
ANALIZZANDO CORRISPONDE AL GENE CHE CODIFICA PER LA ALPHA-GALATTOSIDASI E
CHE C’E’ UNA DIFFERENZA FRA IL GENE DEL PAZIENTE E IL GENE DI UN INDIVIDUO SANO
Query
721
Sbjct
750
paziente
AGTATCTTGCACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG
||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG
78
809
Banca dati/sano
LA DIFFERENZA CHE VEDIAMO AL LIVELLO DEL DNA DEL PAZIENTE
PUO’ ESSERE ANALIZZATA AL LIVELLO DELLA PROTEINA.
CIOE’ POSSIAMO TRADURRE LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL GENE
DEL PAZIENTE UN PO’ COME AVVIENE NELLA CELLULA.
POTETE FARLO VOI STESSI SE CONOSCETE IL CODICE GENETICO.
DESIDERATE UN PICCOLO SUGGERIMENTO
TRASCRIZIONE DEL DNA E LA TRADUZIONE ?
RIGUARDO
ALLA
Ricordiamo?
L’mRNA così
formato migra
nel citoplasma
Nei ribosomi avviene il processo di TRADUZIONE
che è l’inizio della sintesi delle proteine
Ricordiamo?
L’RNA di trasporto
(tRNA) porta con sé
un amminoacido.
Il ribosoma è la
fabbrica della proteina.
Il codice è formato di
triplette
di
basi
chiamate codoni.
Ricordiamo?
Query
721
Sbjct
750
AGT ATC TTG CAC TGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG
||| ||| ||| | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGT ATC TTG GAC TGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG
S
I
L
732:3=244
p.D244H
780
809
ABBIAMO SCOPERTO CHE:
•
IL PAZIENTE HA UNA MUTAZIONE NEL GENE DELLA ALPHA GALATTOSIDASI
•
QUESTA MUTAZIONE COMPORTA LA SOSTITUZIONE DI UN AMMINOACIDO,
L’ACIDO ASPARTICO 244 CON UNA ISTIDINA
MA QUAL’E’ LA FUNZIONE DELLA ALPHA GALATTOSIDASI?
ALPHA
GALATTOSIDASI
GALATTOSIO
MA
COME
QUALE
E’
LA
STRUTTURA
TRIDIMENSIONALE
DELLA
ALPHA-
GALATTOSIDASI?
INTERROGHIAMO UN SITO PER CONFRONTARE LA SEQUENZA DEL PAZIENTE CON
QUELLA DI RIFERIMENTO UMANA.
IL PROGRAMMA SI CHIAMA BLAST (BLASTX)
NELLA PAGINA CHE APPARIRA’ INSERIREMO LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL
PAZIENTE E SCEGLIEREMO COME ORGANISMO “HOMO SAPIENS” E SCEGLIAMO
COME BANCA DATI PDB, LA BANCA DATI DOVE SONO CONSERVATE LE STRUTTURE
DELLE PROTEINE.
NELLE DIAPOSITIVE SUCCESSIVE VEDRETE COME SI PRESENTERA’ L’INPUT E
QUALE SARA’ L’OUTPUT.
IL
PROGRAMMA
SI
CHIAMA
BLASTX
INSERIREMO
LA
SEQUENZA
NUCLEOTIDICA DEL PAZIENTE,
SCEGLIEREMO COME BANCA
DATI PDB E COME ORGANISMO
“HOMO SAPIENS”
poi
DA USARE PER LA RICERCA
NELLA
PROTEIN
DATA
BANK PDB
NELLA PAGINA DELL’OUTPUT GUARDATE A DESTRA.
TROVATE UN LINK “DOWNLOAD FILES”
SI APRIRA’ UNA TENDINA, SCEGLIETE PDB File (TEXT)
PER VISUALIZZARE LA STRUTTURA DI UNA PROTEINA ABBIAMO BISOGNO DI UN
PROGRAMMA DI GRAFICA.
NE ESISTONO VARI, IL PIU’ SEMPLICE E’ RASMOL CHE SI PUO’ SCARICARE
GRATUITAMENTE.
TROVERETE IL PROGRAMMA NELLA CARTELLA CHE AVETE SCARICATO.
APRITE IL FILE 1R46 CON RASWIN
ANDATE SU COLOURS E SCEGLIETE CHAIN
VEDRETE CHE L’ALPHAGALATTOSIDASI E’ FATTA DA DUE CATENE UGUALI.
CERCATE LA FINESTRA DI CONTROLLO DI RASWIN E SCRIVETE: SELECT 231 OR 170
(CON QUESTO COMANDO AVETE SELEZIONATO I DUE AMMINOACIDI DEL SITO ATTIVO
OSSIA LE “MANI” DELL’ALPHA-GALATTOSIDASI)
CONTINUATE POI A SCRIVERE IN SEQUENZA:
COLOR GREEN
SPACEFILL
SELECT 244 (QUESTO E’ L’AMMINOACIDO MUTATO NEL PAZIENTE)
COLOR RED
SPACEFILL
VEDRETE CHE IL SITO DELLA MUTAZIONE E’ LONTANO DAL SITO ATTIVO, PER QUESTO
L’ENZIMA DEL PAZIENTE E’ ANCORA IN GRADO DI FUNZIONARE SE STABILIZZATO
DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA
ABBIAMO LANCIATO 2 PROGRAMMI, BLAST, UN PROGRAMMA CHE DATA UNA
SEQUENZA, CERCA IN UNA BANCA DATI UNA SEQUENZA IDENTICA O SIMILE, E RASMOL,
UN PROGRAMMA PER LA VISUALIZZAZIONE DELLE STRUTTURE DELLE PROTEINE.
ABBIAMO UTILIZZATO DUE BANCHE DATI, UNA
NUCLEOTIDICHE ED UNA BANCA DATI DI PROTEINE.
BANCA
DATI
DI
SEQUENZE
ABBIAMO VERIFICATO CHE IL PAZIENTE HA UNA MUTAZIONE NEL GENE DELL’ALPHA
GALATTOSIDASI, CHE LA MUTAZIONE MODIFICA UNA PROTEINA IMPORTANTE, MA CHE
LA MODIFICA NON IMPEDISCE ALLA ALPHA GALATTOSIDASI DI FUNZIONARE.
LA PROTEINA MUTATA E’ PIU’ “DEBOLE” DI QUELLA SANA, MA POTREBBE ESSERE
RINFORZATA LEGANDO AD ESSA UN FARMACO.
DOBBIAMO CERCARE IN UNA BANCA DATI CHE CONTIENE STRUTTURE CHIMICHE LA
MOLECOLA CHE HA LA CAPACITA’ DI LEGARSI ALL’ALPHA GALATTOSIDASI.
RICORDERETE CHE LA ALPHA GALATTOSIDASI PRODUCE GALATTOSIO.
LA PROTEINA LEGA GALATTOSIO, GALACTOSE IN INGLESE.
PROVIAMO A CERCARE IN ZINC NEL MODO PIU’ SEMPLICE, TEXT, UNA
MOLECOLA SIMILE AL GALATTOSIO, GALACTO*
CONOSCIAMO LA STRUTTURA DELLA PROTEINA, 1R46, OTTENUTA
DALLA BANCA PDB, ABBIAMO SCELTO UNA MOLECOLA, 1636704,
OTTENUTA DALLA BANCA DATI ZINC.
ABBIAMO BISOGNO DI UN PROGRAMMA CHE PREVEDA COME LA
MOLECOLA SIMILE AL GALTTOSIO POSSA LEGARSI ALLA ALPHA
GALATTOSIDASI.
IL PROGRAMMA SI CHIAMA SWISSDOCK, E’ GRATUITO MA MOLTO
LENTO.
NELLA DIAPOSITA SUCCESSIVA VEDRETE LA PAGINA DELL’INPUT
DOVE INSERIREMO COME TARGET 1R46 E COME LIGAND 1636704.
DALLO STUDIO IN SILICO ALLO STUDIO IN VITRO
SENZA LIGANDO
-
CON LIGANDO
+
COLTURE DI
FIBROBLASTI
ALPHA GALATTOSIDASI
ANALISI MEDIANTE
ELETTROFORESI DI PROTEINE E
VISUALIZZAZIONE MEDIANTE
L’USO DI ANTICORPI SPECIFICI
GRAZIE PER L’ATTENZIONE E GRAZIE A…..
TELETHON PER AVER FINANZIATO LA
NOSTRA RICERCA