Lez11 aromatici anaerobico Archivo

Biodegradazione anaerobica di alcani (p.es. esadecano)
Degradazione anaerobica di composti aromatici
 Composti aromatici a basso PM possono essere il substrato di crescita di molti
batteri anaerobici
 Passaggio chiave del processo di degradazione anaerobica è la riduzione
dell’anello aromatico che porta alla perdita di aromaticità
 Come nel metabolismo aerobico, anche in quello anaerobico esistono dei
pathways periferici che trasformano tutti i composti aromatici in pochi intermedi
che fanno parte di un pathway centrale.
L’enorme varietà di substrati aromatici viene trasformata in pochi intermedi
centrali facilmente riducibili
Fluoroglucinolo – Ha debole carattere aromatico ed è enzimaticamente ridotto con
NADH
OH
HO
OH
Resorcinolo – Ha maggior carattere aromatico. Viene ridotto da riducenti piu’
potenti (ferredossina)
OH
OH
Benzoil-CoA, un tioestere con forte carattere aromatico, viene ridotto con
ferredossina, in presenza di ATP
Reazioni di dearomatizzazione in pathways
aerobici e anaerobici
acido gentisico
acido protocatecuico
benzoilCoA
floroglucinolo
resorcinolo
Pathways periferici
La degradazione anaerobica degli aromatici avviene, attraverso pathways
periferici, trasformando i composti in intermedi centrali che sono
benzoilCoA
resorcinolo
floroglucinolo
Pathways periferici
CoA
Altri intermedi centrali di
pathways anaerobici
 Oltre al benzoilCoA altri intermedi centrali dei
pathways anaerobici sono:
OH
OH
resorcinolo
OH
HO
floroglucinolo
OH
Hanno scarsa aromaticità e possono essere facilmente ridotti.
 Gli enzimi che riducono resorcinolo e floroglucinolo sono meno complessi della
benzoilCoA riduttasi e non richiedono energia per la riduzione dell’anello
Le vie del floroglucinolo e del resorcinolo
Non necessitano di attivazione per essere ridotti
Floroglucinolo riduttasi
L’enzima è stato isolato e purificato da Eubacterium oxidoreducens, in forma solubile e omodimera
HO
(MW 78000).
OH
HO
O
+
NADPH + H+
+
OH
+
NADP
O
1,3 diosso-5-idrossi-cicloesano
Resorcinolo riduttasi
E’ sensibile ad O2 e non necessita di nucleotidi piridinici, ma viene ridotto da una ferredossina.
OH
E’ specifico per resorcinolo e suoi analoghi
O
+
2 e-
+
2H
+
OH
Il prodotto viene idrolizzato subito a 5-ossoesanoato
O
1,3-diosso-cicloesano
OH
Resorcinolo idratasi
E’ la via di degradazione seguita da A. denitrificans.
L’enzima catalizza l’idrolisi diretta del resorcinolo senza
riduzione dell’anello aromatico
+
OH
COOH
H2O
CH3
O
5-osso-esa-2-enecarbossilato
Il pathway centrale da resorcinolo e floroglucinolo a acetil-CoA
riduttasi
(NADPH)
1,3 diosso-5-idrossicicloesano
1,3 diosso-cicloesano
-ossid.
idrolasi
3-idrossi-5ossoesanoato
deidrogenasi
(NADP+)
3,5-diossoesanoato
acetil-CoAtriacetato-CoA
transferasi
triacetil-CoA
- chetotiolasi
5-osso-esa-2ene-carbossilato
5-osso-esanoato
-ossid.
Riduzione enzimatica dell’anello
aromatico
 L’enzima catalizza il trasferimento di 2 elettroni dalla ferredossina ridotta al benzoil CoA.
formando cicloesa-1,5-diene-1-carbossil-CoA.
C6H5-CO-SCoA + 2 MgATP + 2 e- + 2 H+ + 2 H2O
C6H7-CO-SCoA + 2 MgADP + 2 Pi
OC
SCoA
OC
SCoA
riduttasi
H
H
H
benzoil-CoA
In R. palustris il prodotto è
H
cicloesa-1,5-diene-1-carbossil-CoA
OC
SCoA
OC
SCoA
H
riduttasi
H
cicloesa-1,4-diene-1-carbossil-CoA
H
H
Riduzione enzimatica dell’anello
aromatico
 L’enzima che riduce il benzoil CoA è una riduttasi.E’ stata isolata da R. palustris e
da Thauera aromatica
 PM 160000, tetramero costituito da 4 subunità diverse (a, MW 49000, b, MW 48000,
c, MW 44000, d, MW 29000) con alta omologia tra i vari organismi (25-70%).
Contiene 3 cluster Fe4S4.
 Le subunità a e d contengono ciascuna un motivo di legame per l’ATP.
Sulla base del confronto con un enzima simile (attivasi/deidratasi da Acidaminococcus
fermentans) che catalizza l’eliminazione di una molecola di acqua da  idrossi CoA
tioesteri, di cui è nota la struttura, sono fatte ipotesi sulla struttura e sul meccanismo di
reazione della riduttasi.
Si ipotizza che un cluster sia legato a ponte tra le subunità a e d.
Le altre subunità legherebbero il benzoil CoA e gli altri 2 cluster.
Riduzione enzimatica dell’anello aromatico
 La reazione di riduzione è accoppiata all’idrolisi dell’ATP.
 Benzoil-CoA riduttasi catalizza lo scambio isotopico da 14C-ADP a ATP suggerendo
la formazione di un intermedio dell’enzima fosforilato.
 In assenza di substrato riducibile la riduttasi nella forma ridotta mantiene attività
ATPasica.
 Uno dei cluster [4Fe-4S]+1 ridotti passa dallo stato basso spin S=1/2 all’alto
spin S=7/2. L’energia rilasciata dall’idrolisi del legame fosforico dissipata come calore.
In presenza di substrato gli elettroni attivati sono trasferiti all’anello benzenico
Riduzione dell’anello aromatico
E°(1a) = -3.15 V
E°(2a) = -1.8 V
E° (1b) = -0.25 V
Vantaggi della riduzione biologica del benzoilCoA
 La reazione viene catalizzata dalla benzoilCoA riduttasi.
 La parte nucleotidica del CoA facilita il legame del substrato e assicura la corretta posizione
dell’acido aromatico nel centro attivo dell’enzima
 La presenza del gruppo –CO-SCoA innalza il potenziale di riduzione (E° (2a) = -1.8 V)
 L’enzima che catalizza questa reazione (benzoilCoA riduttasi) richiede tuttavia energia
per fare avvenire la reazione
Birch Reduction
Meccanismo della benzoil-CoA riduttasi
cicloesa-1,5-diene-1 carbossil-CoA
 La reazione della benzoil-CoA riduttasi procede attraverso 2 reazioni successive,
monoelettroniche
 Il radicale anione generato nel primo step viene stabilizzato dall’uptake di un protone
 Segue una seconda riduzione e protonazione
Sorgente di elettroni per la riduzione enzimatica
 Gli elettroni vengono trasferiti alla benzoil-CoA riduttasi da una ferredossina (PM 9000, 2 clusters Fe4S4
(E° = -435 mV, E° = -585 mV). La ferredossina viene ridotta da 2-oxoglutaril:ferredossina riduttasi e fa da shuttle
di elettroni tra il ciclo dell’acido citrico e la riduzione enzimatica dell’anello del benzene
Electron transfer from 2-oxoglutarate to the
aromatic ring catalysed by 2-oxoglutarate:
ferredoxin oxidoreductase and benzoyl-CoA
reductase. Note that three molecules of
2-oxoglutarate are formed per molecule of
benzoyl-CoA reduced. However, oxidation of
one molecule acetyl-CoA would be sufficient
to the provide electrons required for the
reduction of one molecule benzoyl-CoA.
The surplus of reduced ferredoxin is
suggested to be chaneled to NAD+, catalysed
by ferredoxin: NAD+ oxidoreductase.
Pathway centrale da benzoil-CoA a
acetil-CoA e CO2
cicloesa-1,5-diene-1 carbossil-CoA
ox
crotonil-CoA
glutaril-CoA
-ox
3-idrossipimelil-CoA
 Ossidazione di cicloesa-1,5-diene-1-carbossil-CoA produce 3 molecole di acetil-CoA
e 1 molecola di CO2
 Acetil-CoA può essere ossidato via
-ciclo acido citrico
- ciclo del gliossilato
Reazioni metaboliche periferiche
Attivazione di acidi aromatici in CoA-tioesteri
 La reazione è catalizzata da CoA ligasi la cui sintesi è legata alla presenza del substrato
 La formazione del CoA tioestere permette di attivare l’anello aromatico ed è essenziale per l’ulteriore
conversione
 Tutte le CoA ligasi richiedono MgATP (talvolta Mg può essere sostituito da Mn e ATP da CTP) e CoA
 Gli isoenzimi si differenziano per la diversa specificità degli acidi aromatici
 L’acido aromatico viene prima attivato come aciladenilato e poi trasferito al gruppo tiolico del Coenzima A
E + MgATP + RCOOH
[E::R-CO-PAdo + CoASH
[E::R-CO-PAdo +Mg + PPi
R-CO-SCoA + AMP + E
NH2
N
N
O
HO
P
N
O
N
O
OH
AMP, gruppo adenilico
OH
OH
Reazioni metaboliche periferiche
Carbossilazione di composti fenolici o anilinici
 L’anello aromatico viene carbossilato in posizione para rispetto ad uno degli OH
sull’anello
 La carbossilazione avviene in 2 steps:
1) Fosforilazione del substrato
fenolo chinasi
+ X-PO3
2-
+ X-H
O
O
P
O
OH
2) Carbossilazione del fenilfosfato a 4-idrossibenzoato
O
-
-
COO-
fenilfosfato carbossilasi
+ CO2 + H2O
+ H2PO4CO-SCoA
O
O
P
O
O
-
-
L’idrossibenzoato viene poi attivato da CoA ligasi.
Il CoA-tioestere viene poi deidrossilato a benzoilCoA
OH
OH
4-idrossibenzoato + 14CO2
[14C]4-idrossibenzoato + CO2
Reazioni metaboliche periferiche
Deidrossilazione riduttiva
In condizioni aerobiche la presenza sull’anello aromatico di gruppi OH è necessaria per la
rottura dell’anello.
In condizioni anaerobiche l’OH deve essere rimosso per trasformare il substrato in benzoil-CoA,
intermedio centrale
La reazione è una deidrossilazione riduttiva
CO-SCoA
+ 2 e- + 2 H+
OH
CO-SCoA
+ H2O
L’enzima, 4-idrossibenzoil-CoA-riduttasi, isolato da Thauera aromatica, è costituito da 3 diverse
subunità di PM 75000, 35000, 17000 (222).
Contiene 2 centri Fe2S2
2 centri Fe4S4
Mo
Flavina
La reazione avviene in 2 step monoelettronici
Mo, cyan; Fe, magenta; S, green; O, red; N, blue; C, yellow.
Substrate Binding Site4-OHBCoA is modeled into a 6 Å wide channel
in such a way that the Mo-ligated water is replaced by the hydroxy
group of 4-OHBCoA. The benzoyl moiety is flanked by four aromatic
residues comprising Tyrα319, Tyrα326, Hisα360, and Tyrα521
(surface colors: blue, basic; red, acidic; cyan, polar; green, aromatic;
yellow, aliphatic).
Reazioni metaboliche periferiche
Deamminazione riduttiva
Gruppi amminici vengono rimossi in modo analogo ai gruppi OH.
Sono cattivi “gruppi uscenti”. La tioesterificazione facilita la riduzione dell’anello e la seguente
eliminazione di NH3.L’enzima responsabile della reazione non è stato isolato
CO-SCoA
CO-SCoA
NH2
+2 e- + 2 H+
+ NH3
Dealogenazione riduttiva
La dealogenazione riduttiva avviene senza attivazione del substrato.
Infatti gli alogeni sono gruppi uscenti migliori di –OH e NH2.
L’enzima 3-clorobenzoato dealogenasi da Desulfomonile tiedjei è stato isolato
E’ un enzima di membrana, costituito da 2 subunità (PM 64000, 37000).
Contiene un eme c nella subunità più piccola
COOH
COOH
+ 2e- + 2H+
Cl
+ Cl-
Reazioni metaboliche periferiche
-ossidazione di gruppi carbossimetile
 Fenilacetato e idrossi-fenil acetato si formano nella degradazione di alcuni acidi grassi, di fenilalanina,
di tirosina e di monomeri della lignina
 In condizioni anaerobiche possono essere degradati attraverso un meccanismo di -ossidazione.
 Questo è preceduto da una CoA-tioesterificazione che facilita l’ -ossidazione.
 Fenil-acetil-CoA è ossidato a fenil-gliossilato da un sistema enzimatico che catalizza l’ossidazione a
4 elettroni.
COOH
CO-SCoA
CO
CH 2
+ 2 H2O
-ossidazione
+ 4 e- + 4 H+ + CoASH
fenil-gliossilato
 L’enzima fenilgliossilato ossidoriduttasi catalizza la decarbossilazione ossidativa CoA
dipendente del fenilgliossilato a benzoil-CoA
COOH
CO-SCoA
CO
+ 2 e- + H+ + CO2
+ CoASH
benzoil-CoA
Reazioni metaboliche periferiche
Ossidazione di gruppi metile
Due diversi pathways degradativi possono essere seguiti in condizioni anaerobiche
Ossidazione del metile attraverso reazione di idrossilazione
E’ il meccanismo seguito nella degradazione del p-cresolo da parte di batteri denitrificanti.
Porta alla formazione di 4-idrossibenzaldeide
CH OH
2
CH3
H2O
+ 2 e- + 2 H+
OH
OH
CH 2OH
CHO
H2O
+ 2 e- + 2 H+
OH
OH
Condensazione con fumarato
La reazione è catalizzata dall’enzima benzil-succinatosintasi
HOOC
CH3
HOOC
COOH
+
COOH
Il benzil-succinato viene poi ossidato a benzoil-CoA
Condensazione con fumarato: benzil succinato sintasi: una via radicalica per l’attacco
di un substrato non reattivo
L’enzima è stato identificato in batteri
denitrificanti e presenta una subunità
(MW 98000) che contiene un radicale
glicina, oltre a 2 subunità più piccole.
La specie radicalica astrae un atomo di H
dal toluene, generando un radicale benzilico
a cui si addiziona il fumarato.
Il radicale benzilsuccinilico viene convertito
a benzilsuccinato per trasferimento di un
atomo di H dall’enzima
Catabolismo anaerobico del toluene
Toluene:
Aerobic
degradation
Degradation is initiated by
either a mono- or dioxygenase.
Toluene:
Anaerobic
degradation
Conjugation of fumarate to toluene
gives benzylsuccinate
Benzylsuccinate is converted via a -oxidation-like
process to give benzoate (benzyl-CoA).
Benzoate is further metabolized
Proposed pathway for the
degradation of ethylbenzene in the
sulfate-reducing strain EbS7.
A, ethylbenzene; B, (1-phenylethyl)succinate; C, (1-phenylethyl)succinylCoA; D, (2-phenylpropyl)malonyl-CoA;
E, 4-phenylpentanoyl-CoA; F, 3-oxo-4phenyl-pentanoyl-CoA; G, 2phenylpropionyl-CoA.
Olaf Kniemeyer et al. Appl. Environ. Microbiol. 2003;69:760768
Ethylbenzene metabolism in Azoarcus strain EbN1, a denitrifying bacteria
(Mo, Fe-S, eme)
J Bacteriol. 2005 February; 187(4): 1493–1503
a Fumarate addition to
toluene, and subsequent βoxidation of the intermediate
benzylsuccinate to benzoylCoA. Succinate carbons are
indicated by red shading.
b Hydroxylation of
ethylbenzene to 1phenylethanol, and the ATPdependent carboxylation of
acetophenone that is
involved in the conversion to
benzoyl-CoA.
c The proposed carboxylation
of benzene and naphthalene
as the initial step of
anaerobic degradation. The
further metabolic fate of
benzene after carboxylation
to benzoate appears to be
clear, but it is still unknown
whether naphthoyl-CoA is
actually metabolized via
benzoyl-CoA (dotted arrow).
[ATP] indicates the
dependence of the respective
reaction on ATP hydrolysis.
Tre diverse vie perifiche fino a benzoil-CoA
A: addizione di fumarato al toluene
B: -ossidazione del metile del p-cresolo
C: carbossilazione del fenolo
Nature Reviews Microbiology 9, 803-816, 2011
Regolazione della degradazione
anaerobica dei composti aromatici
 La sintesi degli enzimi coinvolti nella degradazione anaerobica è regolata dalla presenza di O2
e del substrato.
 Alcune specie di microorganismi possono crescere aerobicamente o anaerobicamente,
tuttavia gli enzimi sintetizzati e i pathways degradativi di un substrato sono diversi
 L’enzima chiave del pathway centrale della degradazione anaerobica è sempre presente
(benzoil-CoA riduttasi) quando le cellule sono cresciute su substrati aromatici.
Gli enzimi dei pathways periferici sono sintetizzati solo se richiesti.
 I composti aromatici vengono degradati solo quando non sono presenti altri substrati non aromatici.
 Esistono proteine che presiedono a questi fenomeni di regolazione