Enzimi (“nel lievito”): un po’ di storia...
• Il primo nome ad essi assegnato fu fermenti
• 1835: prima teoria della catalisi chimica (Jöns Jacob Berzelius, chimico svedese)
• 1860: fermentazione causata da sostanze termolabili (Louis Pasteur, microbilogo
francese)
• 1877: primo uso del termine enzima
• 1897: estrazione dal lievito degli enzimi che catalizzano
la fermentazione
alcoolica; dimostrazione che la fermentazione può avvenire in assenza di cellule
integre (Eduard Buchner, tedesco, premio Nobel per la chimica)
• 1926: cristallizzazione dell’ureasi (James Sumner, chimico americano)
• 1930: cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli enzimi sono
proteine (John Howard Northrop, americano, premio Nobel per la chimica)
• 1960: teoria dell’allosterismo (François Jacob, Jacques Monod, francesi, premio
Nobel per la Medicina , Jan Pierre Changeaux, genetista francese)
Sono proteine con il compito di catalizzare le reazioni chimiche che
avvengono negli organismi viventi.
Essi si sono evoluti con la funzione di portare all’equilibrio le reazioni
dell’organismo in tempi brevissimi.
La loro regolazione permette all’organismo di selezionare quali
reazioni devono essere accelerate, e quali invece rallentate o anche
bloccate.
Gli enzimi sono i più potenti, efficienti e specifici catalizzatori che si
conoscono.
Gli enzimi sono catalizzatori delle reazioni biochimiche.
Un catalizzatore è una sostanza che non partecipa direttamente alla reazione chimica
(si trova nella stessa quantità prima e dopo la reazione stessa), ma la accelera o la
rende possibile in condizioni ambientali più favorevoli.
Ad esempio la scissione del glucosio richiede una temperatura di 100° e tempi
lunghissimi, mentre gli enzimi permettono una rapida reazione all’interno del corpo
umano.
I catalizzatori sono anche il cardine della moderna chimica industriale, e gran parte
della ricerca si concentra sul ritrovamento di nuovi catalizzatori che rendano i
processi più economici.
Nell’organismo gli enzimi sono indispensabili alla vita: per capire la loro importanza
basta pensare che le reazioni chimiche connesse con un singolo respiro, in assenza di
enzimi, durerebbero ore.
Alcune caratteristiche degli enzimi
• OTTIMIZZARE LA RESA:
– Svolgere solo le reazioni necessarie
– Impedire reazioni indesiderate (specificità di substrato)
– Portare a termine le reazioni in tempi brevi
– Indipendenza dall’ambiente (temperatura, pressione)
– Riutilizzo della stessa “macchina” per molte volte
• MINIMIZZARE GLI SPRECHI:
– Non produrre sottoprodotti (specificità di reazione)
– Minimizzare il dispendio energetico
Energia di attivazione
La conversione X --> Y è termodinamicamente favorevole (Y
si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X), ma la
reazione non può avvenire se X non acquisisce sufficiente
energia per superare la barriera dell’energia di attivazione
Distribuzione di energia in una popolazione di
molecole
• Normalmente, le molecole stabili sono per lo più presenti ad
un livello di energia relativamente basso
• Solo una piccola frazione di esse possiede sufficiente
energia per superare la barriera dell’energia di attivazione
Enzimi: catalizzatori biologici
Reazione non
catalizzata
DG* Reazione
catalizzata
DG*
X
DG
•
•
•
Y
Gli enzimi si combinano transientemente col substrato e ne
abbassano l’energia di attivazione
Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la
velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto
Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e
sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di
reazione
La catalisi enzimatica
Gli enzimi:
• abbassano la barriera dell’energia di attivazione inserendo
stati di transizione più bassi
• stabilizzano lo stato di transizione
Classificazione internazionale degli enzimi
• gli oltre 1500 enzimi noti sono riuniti in sei classi
funzionali:
–
–
–
–
–
–
Ossidoreduttasi
Trasferasi
Idrolasi
Liasi
Isomerasi
Ligasi
Classificazione internazionale degli enzimi
•
•
•
•
•
•
1 - ossidoreduttasi
2 - transferasi
3 - idrolasi
4 - liasi
5 - isomerasi
6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami
con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi
–
–
–
–
6.1
6.2
6.3
6.4
legami
legami
legami
legami
C-O
C-S
C-N
C-C
Reversibilità delle reazioni enzimatiche
• L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi catalizza
anche la reazione inversa
A <====> B
• Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione
diventa praticamente irreversibile
A -----> B <====> C
• Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene
enzimatiche)
Struttura generale degli enzimi
ione metallico
coenzima (vitamina)
gruppo prostetico
(legato covalentemente)
OLOENZIMA
APOENZIMA
(Parte proteica)
Il sito attivo
La maggior parte delle reazioni enzimatiche utilizza substrati che
sono di piccole dimensioni se comparati alla molecola
enzimatica. Di conseguenza solo una piccola parte della
proteina enzimatica si trova a diretto contatto con la molecola del
substrato a formare il COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO (ES).
Le porzioni di enzima a contatto con il substrato che giocano un
ruolo diretto nel processo catalitico costituiscono il cosiddetto
SITO ATTIVO (o CATALITICO). Il resto della proteina enzimatica
fornisce una specie di scheletro strutturale che garantisce il
mantenimento dei componenti del sito attivo nella conformazione
tridimensionale necessaria ad una efficiente e specifica catalisi.
L’elaborazione matematica mirata a correlare la velocità di una reazione
enzimatica con la quantità di enzima presente è chiamata derivazione di
Michaelis-Menten
Questa relazione fornisce la descrizione analitica delle interazioni esistenti
tra Vmax, v e [S]
Come variano le
concentrazioni dei vari
componenti durante la
reazione
Con queste assunzioni si ricava l'equazione di Michaelis-Menten.
Cinetica enzimatica
• 1913: Michaelis e Menten
• approccio cinetico basato su:
assunzione del “quasi equilibrio” (“equilibrio rapido”)
assunzione della velocità iniziale
GRAFICO DI MICHAELIS MENTEN
L'equazione di Michalis Menten è un‘ IPERBOLE EQUILATERA e l'enzima viene
caratterizzato da due costanti:
Km, cioè la concentrazione del substrato per cui v è metà della Vmax.
Vmax, la velocità massimale della reazione che si ha quando [S]>>Km
L’equazione di Michaelis-Menten descrive un’ iperbole rettangolare
avente come asintoti Vmax e -Ks ( o -Km).
KM é ...
[S] alla quale v = Vmax/2
[S] alla quale metà dei siti attivi
dell’enzima sono occupati
KM = legame >, affinità >
Il valore della Km è importante perché:
a) è una costante specifica per ogni enzima
b) è una stima della concentrazione intracellulare del substrato.
c) lo studio dell' effetto di diversi composti sulla Km permette di
identificare eventuali inibitori.
d) conoscendo il valore della Km di un enzima, è possibile misurarne
la
Vmax ( [S]>>Km ) che è una misura indiretta di [Etot].
Inibizione enzimatica
In molti casi, piccole molecole specifiche o ioni possono competere con le
molecole di substrato nel legarsi con l’enzima ed inibire l’attività dell’enzima.
Quando ciò si verifica, le molecole di enzima, costrette a impegnarsi anche con
gli inibitori, solo in parte si legano alle molecole di substrato. Questo
fenomeno, automaticamente, riduce la velocità di reazione ed abbassa il
turnover dell’enzima. L’inibizione viene sfruttata da molti farmaci quando si
vuole curare una malattia in modo molto selettivo. L’inibizione può essere
irreversibile e reversibile.
E’ irreversibile quando l’inibitore e l’enzima si legano con legame molto forte
per formare il complesso EI e la reazione di ritorno risulta molto lenta o non
avviene per niente in quanto l’enzima è inattivato e non è più in grado di legare
il substrato normale. Un esempio di inibizione irreversibile è dato dall’azione
dei gas nervini che bloccano l’azione dell’enzima acetilcolinesterasi, un enzima
che ha un ruolo importantissimo nella trasmissione degli impulsi nervosi.
L’inibizione reversibile può essere competitiva, quando gli inibitori sono, da un
punto di vista chimico, molto simili alle molecole di substrato e si legano agli
stessi siti attivi, e non competitiva, quando gli inibitori si legano a siti
dell’enzima diversi da quelli che legano il substrato e, pertanto, possono
legarsi sia all’enzima che al complesso ES. Possono, però, anche instaurare
con l’enzima un legame che deforma spazialmente i siti di legame del substrato
e impedire la formazione del complesso ES.
Inibizione enzimatica
Ogni sostanza che riduca la velocità di una reazione enzimatica è da
considerarsi un INIBITORE. L’inibizione può essere IRREVERSIBILE o
REVERSIBILE; un inibitore reversibile forma legami non covalenti e
transitori con l’enzima. La formazione reversibile di un legame non
covalente con una molecola diversa dal substrato porta alla
formazione di complessi anomali, non produttivi, che non fanno parte
del normale processo catalitico. Ci sono 3 tipi principali di inibizione
reversibile: Competitiva, Non Competitiva, Acompetitiva.
• Reversibile
– Competitiva
– Non competitiva
• Nella trattazione cinetica
della inibizione enzimatica
si applicano le assunzioni
di Michaelis-Menten anche
all'inibitore
– Acompetitiva
KI
• Irreversibile
E+I
EI
A) Inibizione competitiva.
Un inibitore competitivo è una sostanza che si lega
all'enzima libero, impedendo così la formazione del
complesso enzima-substrato (ES). Esso può essere un
analogo non metabolizzabile del substrato, un substrato
alternativo per l'enzima o un prodotto di reazione.
B) Inibizione non-competitiva.
In un tipico sistema di inibizione non-competitiva
l'inibitore non ha alcun effetto sul legame del substrato
con l'enzima, ed il substrato non ha alcun effetto sulla
formazione del legame tra inibitore ed enzima, in quanto
entrambi si legano reversibilmente all' enzima in siti
differenti
C) Inibizione acompetitiva.
Il tipico.inibitore acompetitivo è una sostanza che si lega
reversibilmente al complesso ES dando origine al
complesso non produttivo ESI.
Enzimi con siti catalitici multipli cooperativi: enzimi allosterici.
Se il legame di una molecola di substrato (o di altro legante) con l'
enzima induce cambiamenti strutturali tali da alterare le affinità dei
siti vacanti, la curva di v / [S] non seguirà più la cinetica di MichaelisMenten e l'enzima sarà classificato come allosterico. Generalmente,
ma non sempre, gli enzimi allosterici hanno delle curve v/[S] di tipo
sigmoidale.
Se il legame di una molecola di substrato (o di altro legante) facilita il
legarsi di ulteriori molecole di substrato come conseguenza di una
aumentata affinità dei siti vacanti si parla di EFFETTO COOPERATIVO
POSITIVO.
I vantaggi potenziali di una risposta sigmoidale si possono constatare
comparando tra loro una una iperbolica con una sigmoidale.
REGOLAZIONE ALLOSTERICA
La regolazione allosterica è un esempio di modulazione delle vie metaboliche in
modo tale da adattare le velocità di reazione alle esigenze funzionali della cellula.
Nel metabolismo cellulare vi sono gruppi di enzimi che lavorano insieme in vie
sequenziali per condurre un certo processo metabolico. La velocità complessiva di
tutta la reazione è determinata da un enzima "chiave" che regola la tappa più lenta
dell’intero processo.
Questi enzimi regolatori presentano un'attività catalitica aumentata o diminuita in
risposta a certi segnali che sono in genere costituiti da piccole molecole o cofattori.
Mediante l'azione di tali enzimi, la velocità di ogni sequenza metabolica si adegua
costantemente alla domanda cellulare di energia e di biomolecole necessarie per il
mantenimento della cellula.
Gli enzimi allosterici agiscono mediante il
legame reversibile non-covalente di un
metabolita regolatore, detto effettore
(inibitore o attivatore), e sono in grado di
acquisire nuove conformazioni. Gli
effettori
allosterici
non
agiscono
direttamente sul sito catalitico, ma
indirettamente ne modificano la struttura
fissandosi su un altro sito ad essi
destinato (sito allosterico).
Il legame di un attivatore/inibitore al sito allosterico determina una
modificazione conformazionale dell'enzima tale da condizionare l'attività
catalitica dell'enzima stesso. Entrambi i processi di inibizione ed
attivazione sono reversibili in quanto il distacco dell'effettore allosterico
(inibitore o attivatore) determina il ritorno dell'enzima alla conformazione
iniziale, attiva o inattiva.
La
regolazione
nell'attivare/inibire
con
legame
proteine
covalente
specifiche
consiste
mediante
il
trasferimento di gruppi funzionali. Un classico esempio di
processo biologico con regolazione covalente è il legame tra
un ormone peptidico o un fattore di crescita e un recettore di
membrana che determina una serie di reazioni a cascata. Il
cambiamento
conformazionale
del
recettore
attiva
il
trasduttore (T) il quale a sua volta acquista la capacità di
attivare un amplificatore (A). Quest'ultimo converte uno
specifico precursore (X) nel "secondo messaggero" il quale
attiva un effettore che determina la risposta funzionale della
cellula bersaglio allo stimolo iniziale.
La glicogeno fosforilasi è un enzima omodimerico che esiste in due
stati conformazionali T (meno attiva) ed R (più attiva): il glicogeno
si lega preferenzialmente all'enzima nella forma R
La glicogeno fosforilasi fosforilata è quella più attiva (fosforilasi a);
nel fegato è inibita allostericamente dal glucosio che si lega alla
forma
T)
La fosforilasi b (non fosforilata) è comunque sufficientemente attiva
per produrre
glucosio-1-fosfato utilizzato nella glicolisi per
generare l'ATP necessario per l'attività basale delle cellule sia
epatiche che muscolari. Nel muscolo la fosforilasi b è attivata da
AMP (attivatore allosterico che si lega alla forma R) ed inibita da
ATP e glucosio-6-fosfato (inibitori allosterici che si legano alla
forma T)
Modificazioni covalenti
Un'altra modalità di regolazione dell'attività enzimatica è quella che si
realizza attraverso modificazioni covalenti della proteina enzimatica.
La
più
comune
di
esse
consiste
in
reazioni
fosforilazione/defosforilazione della catena polipeptidica.
di
I residui amminoacidici coinvolti sono la serina, la tirosina o la treonina,
ai quali si lega, mediante un legame estere, un gruppo fosforico.
Le modificazioni di questo tipo sono reversibili e sono catalizzate da
enzimi specifici:
le proteina-cinasi, che provocano la fosforilazione dell'enzima;
le proteina-fosfatasi, che ne provocano la defosforilazione.
La fosforilazione può avere sia l'effetto di attivare, sia quello di
inattivare
un
enzima.
Generalmente, questo tipo di regolazione è diretto su un enzima-chiave
di una via metabolica ed è chiaramente finalizzato a regolare l'intera via,
in maniera razionale e funzionale.
