La relazione gene-enzima Garrod (1908) studia l’ alcaptonuria, malattia trasmessa con modalità autosomica recessiva Conclude che i pazienti mancano di un Enzima che ossida l’ acido omogentisico: MUTAZIONE GENICA= ASSENZA DI ENZIMA Summer (1926) purifica l’ ureasi e dimostra che questo enzima è una proteina Ipotesi un gene-un enzima Beadle e Tatum (1940): cercarono le mutazioni che interferiscono con le reazioni metaboliche Usarono ceppi Wilde-Type di Neurospora (cresce come aploide) capaci di crescere in terreno minimo (zucchero, sali e biotina). Tramite radiazioni ionizzanti ottennero dei mutanti, capaci di crescere in un terreno completo o in un terreno minimo + il composto richiesto per la crescita (essenziale) Ogni ceppo mutante presentava una mutazione in un solo locus genico e ciascun locus genico influenzava solo un enzima (un gene – un enzima) Pauling (1949): la struttura dell’ Hb può essere alterata dalla mutazione di un singolo locus L’ RNA E’ l’ intermediario fra DNA e proteine Fornisce l’ informazione per dirigere la sintesi proteica E’ a singolo filamento Contiene il ribosio L’ Uracile sostituisce la Timina (UA= basi complementari) Trascrizione e traduzione Un RNA messaggero (mRNA) a singola elica viene trascritto da una semielica del DNA (filamento stampo) e porta l’ informazione per la sintesi proteica Nel processo di traduzione la sequenza nucleotidica viene tradotta nella sequenza aminoacidica: la sequenza di tre nucleotidi (tripletta) dell mRNA chiamata codone determina l’ incorporazione di un AA Gli RNA di trasferimento (tRNA) sono degli adattatori: da una parte tramite l ‘anticodone si legano per complementarietà al codone del mRNA e dall’ altra portano lo specifico AA Gli AA portati dai tRNA devono legarsi tramite legami peptidici nell’ ordine dettato dal messaggero e a questo sono deputati i ribosomi. Questi organuli fatti da Pt. e RNA ribosomale (rRNA) si attaccano all’ estremità del mRNA e permettono ai tRNA di decifrare il messaggio. Il codice genetico (I) Come fanno 4 nucleotidi a codificare per 20 AA? Nel 1961 Crick e Brenner ipotizzarono che il codice fosse basato su triplette non sovrapposte: 4 basi si possono unire a 3 a 3 dando 64 combinazioni possibili Nirenberg e Matthaei (1968) provano sperimentalmente che specifiche triplette codificano per specifici AA: l’ mRNA poli U codifica per Phe; il poli A per Lys; il poli G per Gly; il poli C per Pro etc. UAA, UGA, UAG non codificano per alcun AA, ma sono codoni di stop o terminazione Il codice genetico si riferisce all’ mRNA, mentre le sequenze sul DNA o dell’ anticodone del tRNA sono complementari Il codice genetico (II) E’ universale (solo in alcuni protozoi UAA e UGA codificano per Glu e non sono di Stop) e quindi si è evoluto molto precocemente E’ ridondante o degenerato (solo Met e Trp sono codificati da una sola tripletta, mentre per gli altri AA ci sono da due a sei triplette-sinonimi che in genere differiscono per il terzo nucleotide) La trascrizione (I) Le RNA polimerasi DNA dipendenti sintetizzano mRNA, tRNA e rRNA su uno stampo di DNA Utilizzano nucleosidi trifosfati che vengono idrolizzati liberando PP (tranne il primo all’ estremità 5’ che resta trifosfato) La sintesi di RNA avviene in direzione 5’→3’ su uno stampo di DNA letto in direzione 3’→5’. La trascrizione (II) Il promotore è la sequenza di DNA non trascritta alla quale si lega l’ RNA polimerasi per iniziare la trascrizione della regione codificante per la proteina Quando la RNA Polimerasi riconosce il promotore si srotola la doppia elica ed avviene la trascrizione senza bisogno di primer Il termine della trascrizione è controllato da sequenze di terminazione che determinano il distacco della DNA pol dal DNA stampo e dall’ RNA neosintetizzato In genere uno solo dei due filamenti di una regione codificante viene trascritto Uno stesso filamento può fungere da filamento trascritto per alcuni geni e da filamento non trascritto per altri L’ mRNA contiene sequenze non codificanti L’ RNA polimerasi inizia la trascrizione di un gene a monte della sequenza codificante L’ mRNA ha al 5’ una sequenza leader non codificante fondamentale per l’ interazione con il ribosoma La sequenza codificante contiene il messaggio per la proteina e termina con un codone di stop (UAA,AGA,UAG) Infine ci sono sequenze non codificanti trailing al 3’ di lunghezza variabile La traduzione Negli eucarioti l’ mRNA va dal nucleo al citoplasma dove avviene la traduzione della sequenza nucleotidica in sequenza aminoacidica Sono necessari degli adattatori molecolari, i tRNA Le aminoacil tRNA sintetasi legano i rispettivi AA ai t RNA con consumo di ATP Si originano gli aminoacil tRNA in grado di legarsi all’ mRNA nel giusto ordine per originare la Pt RNA transfer I tRNA sono costituiti da 70-80 nucleotidi con sequenze comuni e sequenze uniche Alcune regioni si appaiano, mentre altre formano anse L’ ansa 2 costituisce l ‘anticodone che riconosce il codone dell’ mRNA Al 3’ OH c’è l’estremità che lega il gruppo COOH dell’ AA (mentre il gruppo NH2 partecipa alla formazione del legame peptidico) Sono riconosciuti dalle specifiche aminoacil tRNA sintetasi Sono riconosciuti dai ribosomi I ribosomi (I) Eucariotici (80S) e Procariotici (70S) sono costituiti da due subunità fatte da rRNA e Proteine L’ rRNA non trasferisce informazioni ma ha funzioni catalitiche, le Pt ribosomali hanno funzione strutturale nel ribosoma , ma non funzione catalitica La subunità maggiore contiene una depressione sulla quale si adatta la subunità minore Fra le superfici di contatto si forma una scanalatura nella quale scorre l’ mRNA I ribosomi (II) I ribosomi hanno 1 sito di legame per l’ RNA e 3 siti di legame per i tRNA Le molecole di t RNA si attaccano a tre siti (depressioni) presenti sul ribosoma Sito P (peptidilico): è occupato dal tRNA che porta la catena polipeptidica crescente Sito A (aminoacilico): a cui si lega l’ aminoacil-tRNA che porta l’ AA da inserire nella catena polipeptidica Sito E (di uscita): sito in cui i tRNA che hanno fornito alla catena l’ AA, escono dal ribosoma Inizio della traduzione nei procarioti (I) Tre fattori di inizio proteici si attaccano alla subunità ribosomale minore La subunità ribosomale minore lega l’ mRNA a livello del codone di inizio (AUG) La sequenza leader, a monte dell’ AUG, aiuta il ribosoma ad identificare l’ inizio della regione codificante dell’ mRNA Il tRNA che porta il primo AA è il tRNA iniziatore e lega una metionina formilata (fMet) come primo AA che in seguito può essere rimossa Inizio della traduzione nei procarioti (II) Il fMet –tRNA iniziatore ha l’ anticodone UAC che si lega al codone AUG rilasciando uno dei fattori di inizio La subunità ribosomale maggiore si assembla con la minore rilasciando i rimanenti fattori di inizio Il complesso di inizio è ora completo Inizio della traduzione negli eucarioti La Met legata al t RNA iniziatore non è formilata Il codone di inizio sull’ mRNA non è identificato grazie alla sequenza leader Il complesso di inizio è più complesso e coinvolge almeno dieci fattori proteici Allungamento (I) Gli AA sono aggiunti al polipeptide in crescita L’ Aminoacil t RNA riconosce il codone nel sito A e vi si lega mediante l’ appaiamento del codone (mRNA) e dell’ anticodone (tRNA) La formazione del legame peptidico richiede proteine (fattori di allungamento) ed energia (GTP) Il gruppo NH2 del nuovo AA sul sito A è allineato al gruppo COOH dell’AA precedente (sito P) e si forma il legame peptidico Allungamento (II) L’AA sul sito P viene rilasciato dal suo tRNA e legato all’ Aminoacil t RNA posto sul sito A Questa reazione è spontanea ma richiede l’ intervento della peptidil transferasi un catalizzatore (ribozima) costituente dell rRNA della subunità ribosomale maggiore Segue la traslocazione del ribosoma (che richiede GTP) processo durante il quale il ribosoma scorre sul mRNA di un codone Ora il codone dell’ mRNA che codifica per l’ AA successivo si trova sul sito A Il tRNA non carico viene rilasciato dal sito E La terminazione In presenza del codone di stop sull’ mRNA non si lega alcun t RNA ed il sito A può legare un fattore di rilascio proteico Quindi il legame fra l’ ultimo AA e il t RNA nel sito P si rompe e si libera il polipeptide Si disassembla il complesso di traduzione: mRNA, fattore di rilascio, tRNA del sitoP, subunità ribosomali