ENZIMI
- (quasi) Tutti gli enzimi sono proteine
- Sono catalizzatori biologici
non vengono alterati dalla reazione che catalizzano
ACCELERANO reazioni chimiche fino a 1020 volte!!!
(efficienza catalitica)
Nota:accelerazione da catalizzatori non enzimatici: 100-10000
Rendono più moderate le condizioni di reazione altrimenti
drastiche per pH, temperatura, pressione…
-Gli enzimi sono catalizzatori biologici
specificità di substrato
substrati = reagenti su cui gli enzimi agiscono
specificità di reazione (assenza di prodotti
secondari)
Possono essere regolati in funzione delle specifiche
esigenze
Che cosa gli enzimi NON fanno:
-NON cambiano l’equilibrio di una reazione
- NON rendono possibile una reazione
termodinamicamente impossibile
-Gli enzimi possono avere
dimensioni variabili
-Solo una piccola parte della
molecola è coinvolta nella catalisi
(sito catalitico o sito attivo),
ma…tutta la molecola è importante
per la funzione
-Alterazioni a siti distanti dal sito
catalitico (anche in un solo aa!!!)
possono ridurre o annullare
l’attività dell’enzima!!!
Per svolgere la sua funzione l’enzima DEVE legare il substrato
Formazione di un complesso enzima-substrato (ES)
Il sito attivo forma una superficie tridimensionale
complementare al substrato
COMPLEMENTARIETA’ GEOMETRICA
COMPLEMENTARIETA’ ELETTRONICA
STEREOSPECIFICITA’
L’enzima lega il substrato mediante
forze di van der Waals, ponti idrogeno,
interazioni idrofobiche…
Chimotripsina: proteasi
Specificità: idrolisi di legami peptidici adiacenti a residui
aromatici o con lunghe catene laterali idrofobiche
Complesso ES
Interazione enzima-substrato
Chiave-serratura
Emil Fisher, 1890
Non tiene conto della flessibilità
conformazionale delle proteine
Adattamento indotto
Daniel Koshland, 1958
Il sito attivo assume una forma
complementare a quella del substrato
solo DOPO che il substrato si è legato
Esochinasi
Glucosio + ATP
glucosio 6-fosfato + ADP
Nomenclatura degli enzimi
Nome del substrato su cui agiscono (o del tipo di
reazione che catalizzano) + suffisso –asi
Es: - ureasi
- Alcool deidrogenasi
- glucosio 6-fosfato isomerasi
- DNA ligasi
- esochinasi
Regole per la classificazione degli enzimi
International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(IUBMB)
Gli enzimi vengono classificati
in base al tipo di reazione
chimica che catalizzano
Classificazione
1. Ossidoreduttasi
2. Trasferasi
3. Idrolasi
4. Liasi
5. Isomerasi
6. Ligasi
Tipo di reazione catalizzata
Reazioni di ossidoriduzione
(deidrogenasi, ossidasi, perossidasi,
reduttasi)
trasferimento di gruppi funzionali
idrolisi
lisi del substrato con formazione di doppi
legami (reazioni di eliminazione)
(nella reazione inversa -reazione di
addizione - agiscono da sintasi)
isomerizzazione
formazione di legami accoppiata all’idrolisi
di ATP
(anche denominate “sintetasi”)
A ciascun enzima vengono assegnati due nomi e un numero
di classificazione:
-Nome corrente (es. esochinasi)
-Nome sistematico (es: ATP glucosio fosfotransferasi)
-Numero di classificazione (es: EC 2.7.1.1)
Enzyme Commission
numero di serie
classe
sottoclasse
sotto-sottoclasse
Di che cosa necessitano gli enzimi per la loro
funzione di catalizzatori biologici?
Solo delle catene laterali di specifici
amminoacidi nel sito attivo
Composti chimici addizionali, i cofattori
ioni inorganici, es. Fe2+, Cu2+, K+ , Mg2+,
Mn2+, Ni2+, Zn2+ ….
complesse molecole organiche e
metallorganiche, i coenzimi
Oloenzima
(attivo)
Enzima
Enzima
cofattore
cofattore
Apoenzima
(inattivo)
Il coenzima legato saldamente all’enzima viene detto
gruppo prostetico
I coenzimi operano come trasportatori di gruppi
funzionali o elettroni
•
•
•
•
•
•
molti coenzimi derivano da vitamine
NAD: Trasferimento di elettroni (ioni idruro H-)
(niacina )
FAD: Trasferimento di elettroni
(riboflavina: vitamina B2)
Piridossal fosfato: Trasferimento gruppi amminici
(piridossina: vitamina B6)
Tiamina pirofosfato: Trasferimento gruppi aldeidici
(tiamina: vitamina B1)
Biotina: trasferimento CO2
(vitamina B8)
Coenzima A e Lipoato: trasferimento di gruppi acilici
(pantotenato: vitamina B5)
Il meccanismo d’azione degli enzimi può
essere trattato da due punti di vista:
-analizzando i cambiamenti energetici che
si verificano nel corso della reazione
- esaminando il modo in cui il sito attivo
favorisce la catalisi dal punto di vista
chimico
Cambiamenti energetici che si verificano durante una reazione
∆G > 0
La reazione richiede energia
DG < 0
Reazione termodinamicamente
favorita
∆G = 0
La reazione è all’equilibrio
DGo’ = variazione di energia libera in condizioni standard
Concentrazione: 1 M di reagenti e prodotti
Pressione: 1 Atm
Temperatura : 298 °K (25 °C)
pH 7
Cambiamenti energetici che si verificano durante una reazione
Stato di transizione = stato ad alta energia che deve essere raggiunto
perché S possa essere convertito in P
Energia libera di attivazione: barriera energetica che separa i
reagenti dai prodotti
La velocità della reazione dipende dal superamento della barriera
energetica per il raggiungimento dello stato di transizione
…in una reazione non catalizzata solo un piccolo numero di molecole
possiede energia sufficiente per raggiungere lo stato di transizione
I catalizzatori abbassano l’energia di attivazione senza alterare
l’equilibrio della reazione
Gli enzimi sono catalizzatori biologici
- non vengono consumati durante la reazione
- non alterano l’equilibrio della reazione
- aumentano la velocità della reazione
come fanno gli enzimi ad abbassare l’energia di attivazione?..
…meccanismo???...
EFFETTI DI LEGAME
energia di legame
prossimità e tensione
stabilizzazione dello stato di transizione
EFFETTI CHIMICI
catalisi acido-base
catalisi covalente
Interazione
E-S
Stato di
transizione
formazione
del prodotto
rilascio
del prodotto
Energia di legame = energia che si libera dall’interazione
enzima-substrato
EFFETTI DI LEGAME
Il numero di interazioni deboli è massimo allo stato di transizione
- Massima energia liberataLe interazioni deboli sono ottimali allo stato di transizione
Abbassamento dell’energia di attivazione
Stabilizzazione dello stato di transizione
- Effetti di tensione
cambiamenti conformazionali conseguenti all’interazione
stabilizzazione dello stato di transizione
L’enzima è complementare allo stato di transizione
gruppi funzionali vicini e nel corretto orientamento
Come leggere un meccanismo di reazione…
Punti = elettroni non condivisi
Frecce ricurve = movimento della coppia
di elettroni (direzione: nucleofilo
elettrofilo)
Se la freccia va da un atomo a un altro
atomo: si forma un nuovo legame tra i
due atomi
Se la freccia va da un legame a un
atomo: rottura del legame; gli elettroni
compaiono come doppietto non
condiviso (o carica negativa) sull’atomo
indicato dalla freccia
Se la freccia va da un legame singolo a
un altro legame singolo: si forma un
doppio legame
..
C
C
C
C
C
C
EFFETTI CHIMICI
Catalisi acido-base
Nota: il pKa della catena laterale degli aa può variare in una proteina:
effetto dell’ambiente circostante…
Catalisi acido-base
EFFETTI CHIMICI
Catalisi covalente
(Ser, Cys, Glu, Asp, Tyr, His)
H2O
R1-COOH
EFFETTI CHIMICI
Catalisi covalente
Triade catalitica: Asp – His - Ser
His57: posiziona correttamente il gruppo OH della Ser e ne aumenta
la nucleofilicità
Asp102: posiziona correttamente His57 e ne aumenta la capacità di
accettare protoni
Triade catalitica: Asp – His – Ser
presente anche in altre proteasi
Es: tripsina (specificità: Lys, Arg)
elastasi (specificità: amminacidi con catene laterali
piccole (es: Ala, Ser…)
chimotripsina (specificità amminoacidi aromatici,
idrofobici voluminosi)
Che cosa conferisce specificità?...........
Enzimi che richiedono cofattori
Catalisi da ioni metallici
- orientamento del substrato nel sito attivo
- stabilizzazione dello stato di transizione
- ossidoriduzione
Enzimi che richiedono cofattori
Enzimi che richiedono coenzimi
Come studiare il meccanismo d’azione degli enzimi?...
Cinetica
Velocità della reazione in funzione di parametri diversi
(concentrazione dei reagenti, temperatura, pH…)
Reazione catalizzata da enzimi
Effetto della [S]
k1
k3
k2
v0 = Vmax [S]
KM +[S]
Equazione di Michaelis-Menten
Reazione non catalizzata
Descrive la variazione della velocità
di una reazione catalizzata da un
enzima al variare
della concentrazione di substrato
Derivazione dell’equazione di Michaelis-Menten
Assunzioni:
-[S] >> [E]
-La velocità della reazione inversa è
trascurabile
-Stato stazionario: [ES] costante
k1
k3
k2
Quando [S] >>[E], la velocità della reazione
è proporzionale alla concentrazione di ES
La dissociazione di ES in E + P è la tappa
limitante
v0 = k3 [ES]
k1
k3
v0 = k3 [ES]
k2
Stato stazionario
K1 [E] [S] = k2 [ES] + k3 [ES]
K1 [E] [S] = (k2 + k3) [ES]
[E] [S] = k2 + k3
[ES]
k1
[E] = [Et] – [ES]
KM
[E] [S] = KM
[ES]
([Et] –[ES]) [S] = KM
[ES]
Stato stazionario
k1
k3
v0 = k3 [ES]
k2
([Et] –[ES]) [S] = KM
[ES]
([Et] –[ES]) [S] = KM[ES]
v0 = k3[Et][S]
KM +[S]
k3[Et] = Vmax
([Et] [S]) –[ES][S] = KM[ES]
[ES] (KM + [S]) = [Et][S]
[ES] = [Et][S]
KM+ [S]
v0 = Vmax [S]
KM +[S]
k1
k3
k2
v0 = Vmax [S]
KM +[S]
KM= k2 + k3
k1
Vmax Vmax S
2 = K + S
m
Km = S
v0 = Vmax∙[S]
Km +[S]
Vmax = Vmax∙[S]
2
Km + [S]
Vmax∙(Km + [S]) = 2∙Vmax∙[S]
Vmax∙(Km + [S]) = 2∙Vmax∙[S]
Vmax
Vmax
Km + [S] = 2∙[S]
Km = 2∙[S] – [S] = [S]
Km = [S]
Velocità di reazione (v0) = quantità di substrato trasformato in
prodotto nell’unità di tempo. Si esprime in mmoli di prodotto/L
(mM)/min.
Vmax = velocità massima della reazione.
Saturazione dei siti attivi dell’enzima
Km = costante di Michaelis-Menten
È la concentrazione del substrato
alla quale la velocità della reazione
è metà della velocità massima. Si
esprime in mmoli/L (mM)
…ancora sulla Km…
k1
k3
k2
- in generale, la Km rappresenta
Km= k2 + k3
l’affinità dell’enzima per il
k1
substrato
- basso valore di Km = alta affinità
(è sufficiente una concentrazione
bassa di substrato per avere ½
Vmax)
-alto valore di Km = bassa affinità
(è necessaria una concentrazione
alta di substrato per avere ½
Vmax)
K3 << k2
Km= k2
k1
-Ogni enzima ha una caratteristica
Km per un determinato substrato
Km1 Km2
La costante catalitica Kcat…
k1
k3
V0 = K3 [ES]
k2
Quando [Et] = [ES]
Vmax = K3 [Et]
V0 = Vmax
K3 = Kcat
Vmax = Kcat [Et]
Kcat = Vmax
[Et]
Kcat = Vmax
[Et]
Kcat = numero di turnover
= numero massimo di moli di substrato
convertite in prodotto nell’unità di tempo
per mole di enzima (per mole di sito attivo
dell’enzima)
Kcat = s-1 è una misura di quanto velocemente
un dato enzima può catalizzare una specifica
reazione
5
Perché è utile conoscere Km, Vmax,Kcat?...
Km è unica per ogni coppia enzima-substrato
Es: Enzimi diversi che agiscono sullo stesso substrato…
Enzimi diversi che
catalizzano la stessa
reazione chimica sono detti
ISOZIMI
v0= Vmax S
KM + S
Pendenza =
1 = Km . 1 + 1
V0 Vmax [S ] Vmax
y = bx + c
y = 1/v0
x = 1/ S
b = Km/Vmax
c = 1/Vmax
L’equazione di Lineweaver-Burk:
- è una trasformazione dell’equazione di Michaelis –Menten
- permette di calcolare in modo più accurato Km e Vmax
Reazione catalizzata da enzimi
Effetto della TEMPERATURA
Reazione catalizzata da enzimi
Effetto del
- stato di ionizzazione di
residui del sito attivo
- stato di ionizzazione delle
catene laterali di tutta la
catena polipeptidica: effetto
sulla struttura nativa
Il pH ottimale rispecchia quello dell’ambiente
in cui l’enzima svolge normalmente le sue funzioni
Altri fattori che possono influenzare l’attività di un enzima….
Molecole che si legano all’enzima e interferiscono
con la sua attività
INIBITORI
INIBIZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
DUE TIPI DI INIBIZIONE
-Inibizione reversibile: l’inibitore si lega e si dissocia
dall’enzima rapidamente (legami non covalenti)
-Inibizione irreversibile: complesso stabile enzimainibitore (legami non covalenti o covalenti) - l’enzima
non recupera più la sua attività
- Competitiva
-Non competitiva
1. Inibizione competitiva: inibitore e substrato hanno lo
stesso sito di legame
Ki = costante di inibizione =
costante di dissociazione del complesso EI
L’inibizione competitiva può essere rimossa
aumentando la concentrazione del substrato
1. Inibizione competitiva: inibitore e substrato hanno lo
stesso sito di legame
Inibitori competitivi = analoghi del substrato
1. Inibizione competitiva: inibitore e substrato hanno lo
stesso sito di legame
Inibitore
Effetto sulla Km
KmApp = aKm
a = 1 + [I]
Ki
enzima
substrato
2. Inibizione non competitiva: l’inibitore si lega ad un
sito diverso da quello del substrato, sia all’enzima libero
che al complesso enzima-substrato
2. Inibizione non competitiva: l’enzima e il complesso ES
legano l’inibitore con la stessa affinità
Effetto sulla Vmax
Inibitore competitivo
(I si lega solo a E)
Inibitore non competitivo
(I si lega sia E sia ES)
Vmax = invariata
Km = aumenta
Vmax = diminuisce
Km = invariata
INIBIZIONE ENZIMATICA IRREVERSIBILE
Diisopropil fluorofosfato
L’inibitore si lega covalentemente ad un gruppo funzionale
dell’enzima necessario per l’attività catalitica
INIBIZIONE ENZIMATICA IRREVERSIBILE
Impiego degli inibitori irreversibili:
Studio dei meccanismi di reazione
(identificazione di residui del sito attivo)
Farmaci
Gli ENZIMI ALLOSTERICI
enzimi la cui attività è influenzata da cambiamenti
conformazionali mediati dall’interazione con piccole
molecole (effettori o modulatori)
effettori o modulatori si legano ad un sito diverso dal sito
attivo
effettori negativi: riducono l’attività dell’enzima
effettori positivi: fanno aumentare l’attività dell’enzima
sono costituiti da più subunità
…sito catalitico e sito del modulatore su subunità diverse…
Velocità della reazione (v0)
ENZIMA ALLOSTERICO
[S]
Modello sequenziale
(Koshland)
Modello concertato
Monod-Wyman-Changeux
(MWC)
Negli enzimi allosterici la curva della velocità di reazione in
funzione della concentrazione del substrato ha un andamento
sigmoidale
Km
K0.5
Un effettore allosterico può
modificare l’ affinità dell’enzima
per il substrato (K0.5) o la velocità
catalitica massima (Vmax) o
entrambi i parametri
Effetto omotropico: il
substrato stesso funge da
effettore positivo
Effetto eterotropico:
l’effettore è un composto
diverso dal substrato
REGOLAZIONE ENZIMATICA
MODIFICAZIONE COVALENTE:
Aggiunta di un gruppo chimico alla catena laterale di specifici
amminoacidi DOPO la sintesi della catena polipeptidica
MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI
H
Glu, Asp
Arg, Lys
Qual è l’effetto di una modificazione post-traduzionale?....
Conseguenze funzionali delle modifiche post-traduzionali:
-Attivazione/inibizione
-Localizzazione
-Acquisizione di una nuova funzione
-Aumento della stabilità meccanica
-Degradazione proteolitica
…………………………..
La fosforilazione è un importante
meccanismo di regolazione delle
vie metaboliche
Enzimi che catalizzano la reazione
di fosforilazione: CHINASI
Enzimi che rimuovono il gruppo fosfato:
FOSFATASI
Regolazione dell’attività della glicogeno fosforilasi
+ Pi
H
OPO32-
REGOLAZIONE ENZIMATICA
Attivazione degli zimogeni
Precursore inattivo (zimogeno o proenzima)
Taglio proteolitico
Enzima attivo
ATTIVAZIONE IRREVERSIBILE!
ATTIVAZIONE DEGLI ZIMOGENI
REGOLAZIONE ENZIMATICA
Attivazione degli zimogeni
Es: attivazione del chimotripsinogeno
pancreas
Intestino tenue
REGOLAZIONE ENZIMATICA
- Inibitori
(piccole molecole che interferiscono con la catalisi- inibizione
reversibile/irreversibile)
-Modulatori allosterici
(effettori positivi/negativi-cooperatività- effetti omotropici/eterotropici)
-Modificazioni covalenti
(modificazioni post-traduzionali reversibili. Molti enzimi del metabolismo
regolati per fosforilazione/defosforilazione)
-Attivazione di zimogeni
(conversione di un precursore inattivo in un enzima attivo mediante taglio
proteolitico)
-Isozimi
-Regolazione dell’espressione genica
(quantità diverse di enzima prodotte in risposta a stimoli specifici)
-Regolazione del turnover
(velocità di sintesi e degradazione)
-Compartimentazione
(-enzimi coinvolti nello stesso processo formano complessi multiproteici
-enzimi coinvolti in vie metaboliche diverse operano in compartimenti
diversi della cellula)
