UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II
LAUREA SPECIALISTICA IN
BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO
INSEGNAMENTO DI
FARMACOLOGIA APPLICATA
(2012/2013)
Titolare
Dr. Roberto Russo
[email protected]
Patologia della malattia di Alzheimer
PLACCHE DI AMILOIDE:
depositi amorfi extracellulari di proteina -amiloide (A)
sotto forma di placche
GROVIGLI NEUROFIBRILLARI:
intreccio intracellulare
di neurofibrille formate da proteina TAU anomala
Placche di amiloide
Sono ammassi di sottili filamenti (7-10 nm) che si formano nello spazio extracellulare
nel cervello dei malati di AD.
Sono costituiti da una forma insolubile del peptide che deriva dalla proteina
precursore del -amiloide (APP) e queste placche possono avere un nucleo denso
centrale.
Una porzione variabile di tali placche contengono anche altre molecole proteiche e
non, e possono essere associate a cellule non neuronali e a processi neuritici
anormali.
Colorazione rosso
congo
GROVIGLI NEUFIBRILLARI
I grovigli neufibrillari sono dovuti a fasci di filamenti insolubili che derivano da alterata
fosforilazione delle proteine TAU, associate al citoscheletro dei neuroni, che si
accumulano nel corpo neuronale
L’iperfosforilazione riduce l’affinità delle TAU per i microtubuli causando una
perdita di stabilità nel neurone e può portare alla modificazione del metabolismo
dell’APP
Causa dell’accumulo delle Placche
Due cause principali dell’accumulo delle placche:
1. Forme dominanti della malattia associate alla disfunzione dei geni
che controllano il metabolismo della proteina amiloide: a-, -, and gsecretasi e preseniline 1 e 2
2. Forme non dominanti della malattia (incluse le forme sporadiche) che
coinvolgono i meccanismi della rimozione della A.
Il precursore dell’amiloide
Blu PS1 Verde APP
Rosso Mutazioni
Giallo sito attivo
La proteina precursore dell’amiloide viene normalmente degradata per l’azione di una
serie di proteasi, chiamate secretasi: a-, -, e g-secretasi che tagliano la proteina in
sequenze specifiche (vedi forbici)
Queste proteasi sono sotto il controllo di due altre proteasi: le preseniline 1 e 2
Mutazioni nelle preseniline, a-, -, e g-secretasi o nella APP stessa determinano
l’accumulo extracellulare di A sono causa di malattia.
APP processing and Aß accumulation
Mature APP (center, inside dashed box) is metabolized by 2 competing pathways:
A) the a-secretase pathway that generates sAPP a and C83 (also known as CTF a; left)
B) and the ß-secretase pathway that generates sAPPß and C99 (right).
Some ß-secretase cleavage is displaced by 10 amino acid residues and generates sAPPß' and C89.
All carboxyterminal fragments (C83, C99, and C89) are substrates for g-secretase, generating the APP intracellular domain (AICD)
and, respectively, the secreted peptides p3 (not shown), Aß (right), and Glu11 Aß.
Aß aggregates into small multimers (dimers, trimers, etc.) known as oligomers.
Oligomers appear to be the most potent neurotoxins, while the end stage senile plaque is relatively inert.
Preseniline e neurotossicità
La g-secretasi sono sotto l’influenza della PS1 e PS2 (complesso
enzimatico)
Mutazioni in queste proteine aumentano la produzione di A, fornendo
un legame patogenico per la deposizione di amiloide;
Le preseniline presentano siti per il taglio da parte delle proteasi
caspasi che vengono attivate durante l’apoptosi;
Rimozione dell’amiloide
Ruolo dell’ApolipoproteinaE (ApoE)
ApoE: Proteina plasmatica implicata nel trasporto del colesterolo
Nel SNC interviene nei meccanismi di crescita e riparazione dopo un danno
Nell’AD la ApoE è legata alle placche di A e ai grovigli neurofibrillari
ApoE inibisce la formazione di fibrille di A, ma perde efficacia se associata ai lipidi
I peptidi amiloidi interagiscono direttamente con ApoE legandovisi e potrebbero
essere poi trasportati all’interno delle cellule neuronali via recettori per ApoE
Nei cervelli di soggetti sani ApoE si lega e sequestra A in modo più
efficiente che in quelli dei malati di AD
La deplezione di colesterolo comporta una riduzione nella produzione e nel rilascio
di A
Possibili cicli patogenici di produzione, clearance e degradazione di A.
I complessi ApoE-A e a2M-A possono essere internalizzati da LRP, quindi vengono degradati nel
lisosoma o trasferiti nel plasma. All’esterno della cellula a2M-A può legare una proteasi che degrada
A oppure può essere degradato da proteasi libere.
L’ipotesi colinergica della
malattia di Alzheimer si
fonda
sulla
scarsa
rilevazione
di
marker
colinergici e su un ridotto
numero di neuroni colinergici
e di recettori nicotinici
dell’acetilcolina
nell’ippocampo
e
nella
corteccia cerebrale.
Terapia farmacologica
nel morbo di Alzheimer
Terapie puntano ad un potenziamento del tono colinergico
• Inibitori dell’Ach esterasi (tacrina-velnacrina) unici in terapia
• Potenziatori del rilascio di Ach (idergina)
• Lecitincolina
•
•
•
•
Vaccini anti -amiloide
Inibitori delle secretasi
FANS
Antiossidanti
Creazione di modelli
animali per la
malattia di Alzheimer
Topi transgenici che esprimono la β-amiloide…
Per studiare gli effetti di questa proteina e come poter
curare questa patologia, dobbiamo costruire dei modelli
animali.
I mammiferi come cani e scimmie sviluppano queste
placche ma per problemi di vario genere non possono
essere utilizzati.
Per questo motivo creiamo dei
topi in grado di sviluppare tale
aggregati.
Modifichiamo il DNA murinico che presenta,
rispetto a quello umano, 3 aa diversi nella
regione del precursore β-amiloide (APP) sul
cromosoma 21.
Si è usato un vettore che presenta il promotore virale JCV
(papovavirus umano con tropismo cervello specifico) seguito dalla
sequenza umana c-term di APP.
Risultato: il topo presenta grande produzione di β-amiloide;
come prova si sono fatti studi con anticorpi specifici contro il peptide
β-amiloide ed analisi di southern-blot.
Il DNA viene “digerito” con l’enzima EcoR1, separato
poi con elettroforesi su gel di agarosio, fissato su
membrana ed ibridato con una sonda specifica
Il numero di copie del frammento è specifico per
ogni linea transgenica; varia dalle 5 alle oltre
100 copie.
Poi isolando l’RNA e facendo RT-PCR con elettroforesi ed ibridazione
si è potuto provare l’espressione del transgene unicamente nel cervello.
TOPI TRASGENICI
Il primo modello di topo transgenico di AD è stato sviluppato nel 1995 da Games
usando un promotore umano (PDGF) che permette l’espressione della proteina
precursore dell'amiloide (da qui il nome –PDAPP-); mostrano un aumento
dell’espressione della proteina umana Aβ1-40 e Aβ1-42 maggiore di circa 5-14 volte.
I topi utilizzati sono quelli del ceppo 129/Sv.
Sono modelli della patologia molto realistici quando troviamo
una iper espressione delle isoforme di APP 751 e 770; in questi casi
avremo depositi di β-amiloide età-dipendenti con perdita delle sinapsi.
Per fare questo è stata indotta la FAD per mutagenesi
sito specifica tra gli esoni 16 e 17 del cromosoma 16, in
cellule staminali embrionali di topo.
TOPI TRASGENICI
• Poco dopo il topo PDAPP è stato sviluppato, un
altro modello di topo transgenico mutante APP
umana, che sovra esprime la doppia forma
mutante svedese di APP695, è stato chiamato
topo Tg2576
• Tg2576 topi sono simili al quelli PDAPP in tale da
con la caratteristica che sviluppano depositi di
placca (Aβ1-40 e Aβ1-42/43) in alcune zone
speicfiche del cervello (corteccia frontale,
temporale, nell’ ippocampo,e nel cervelletto.
TOPI TRASGENICI
• modelli Tau di topi transgenici sono stati
progettati per riprodurre i grovigli
neurofibrillari (NFT) spesso osservata in AD.
• Recentemente, un nuovo topo transgenico
tau, P301S, è stato creato e dimostra una
significativa formazione di NFT progressiva e
perdita neuronale: la formazione di NFT si
trovano nel midollo spinale, tronco encefalico,
cervelletto, diencefalo e telencefalo basale
Procedure sperimentali: Morris Water Maze
Procedure sperimentali: Novel Object Recognition
Procedure sperimentali: Social Recognition
Modelli di memoria ed apprendimento
Passive Avoidance Test
Ratti/Topi che passano da un compartimento illuminato ad uno oscuro dove
ricevono scosse elettriche
Gli animali imparano “l’esperienza” 24h prima dell’esperimento
Active Avoidance Test
L’arrivo della scossa (1.5 mA) al pavimento è preceduto di 5 sec da
uno stimolo sonoro e/o acustico
L’accensione della luce o il suono rappresentano lo STIMOLO
CONDIZIONANTE (CS), la scossa elettrica è lo stimolo
incondizionato (US).
L’animale riceve lo CS e subito prima dell’US fugge dalla parte
opposta della gabbia
Procedure sperimentali: Y- maze
A
B
Si basa sul comportamento di “alternanza” che
caratterizza l’attività esplorativa
In questo tipo di labirinto, il ratto (o topo)
percorre prima un braccio e poi l’altro senza
ripetere l’entrata nel braccio visitato la prima
volta.
C
Nell’unità di tempo (3-5 minuti) si contano il
numero delle entrate e l’alternanza nei 2 bracci
della Y.
Un ratto in condizioni normali alterna
mediamente 4-6 volte nei 2 bracci.
FINE
Morris water maze usato per la memoria spaziale breve:
Imparano x 5 giorni
Probe rimuovi la piattaforma
Reversal metti la piattaforma del quadrante opposto
A
B
Y- maze usato per la working memory
C
Novel object recognition usato per verificare la
preferenza e quindi il ricordo del vecchio oggetto
(familiare) e rispetto a uno nuovo
