Esercitazioni

TITOLAZIONE VIRALE
• La quantità di virus è detta titolo
• Il titolo rappresenta la concentrazione del virus/ml
•Può essere rilevato mediate vari saggi : saggio delle placche,
saggio di trasformazione, saggio per diluizione limite, saggio di
emoagglutinazione
Titolazione per placche e per diluizione limite: saggi di infettività
. il titolo virale può variare a seconda del metodo usato
METODO DELLA DILUIZIONE LIMITE
2-5 post-infezione (p.i)
Vitalita
’
-
+
Colorante vitale
(cristal violetto)
102 103 104 105 106 NI
102 103
104
105 106 NI
C-
Titolo
256
2
diluizioni seriali della
sospensione virale
adsorbimento
1 ora a 37º
rimozione inoculo
il terreno semisolido
impedisce la diffusione
del virus
aggiunta di terreno
semisolido (agar)
incubazione
2-5 giorni a 37°C
colorazione con rosso
neutro o cristal
violetto
visualizzazione e
conta delle placche
TITOLAZIONE PER PLACCHE DI VIRUS HSV-1
Diluizione
virus
10-6
10-7
10-8
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N° placche
N° medio x 10-8
>400
43, 45
44 = 4.4
titolo virale = 8.9 x108 PFU/ml
5, 4
4.5
Altri saggi di infettività
• Saggio dei centri di infezione -
una modificazione del
saggio delle placche in cui le cellule infette vengono mescolate con
cellule non infette e seminate in contenitori per colture cellulari utilizzato per cellule persistentemente infette.
• Saggio dei foci di trasformazione - misura del
potere oncogeno dei virus
Forming Units/ml)
(il titolo è espresso in FFU/ml: Focus-
• Saggio in Immunofluorescenza -
l’infezione è
visualizzata mediante rilevamento degli antigeni virali con anticorpi
specifici (anticorpi primari) e successivo rilevamento del complesso
immune con un anticorpo secondario fluorescente ed osservazione al
microspopio a raggi UV
– il tiolo è espresso in FFU/cell (Fluorescent-Forming Unit/cell) non è
particolarmente accurato,
– E’ utile per virus che non replicano efficientemente.
Misurazione diretta del n° di virioni
Microscopio Elettronico
La sospensione virale, mescolata con una
quantità nota di sfere di latex, viene
osservata al ME
.
sfere di latex
Poxvirus (a
forma di
mattone)
Particelle virali vs. virioni infettanti
rapporto tra il n° totale di particelle virali e il titolo del virus
infettante
non tutte le particelle virali sono infettanti
Saggio di Emoagglutinazione virale
L’adsorbimento del virus sulle emazie costituisce
la formazione di un ponte tra i singoli eritrociti (agglutinazione)
emazia
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virus
Saggio di Emoagglutinazione virale
presenza di virus
assenza di virus
(formazione di un bottone
di eritrociti sul fondo del pozzetto)
Emoadsorbimento (HAD)
HAD negativo
HAD positivo