Batteri anaerobi

Batteri anaerobi
Definizione
Batteri incapaci di crescere sulla superficie di un terreno
solido adatto, incubato in atmosfera ambiente o in
incubatore a CO2
I batteri anaerobi di interesse clinico ricevono energia da
processi fermentativi in cui i composti organici come gli
acidi, gli alcoli ed altri composti servono da accettori finali di
elettroni
Anaerobi obbligati
• Stretti: non tollerano concentrazioni di O2 >0,5%; l’esposizione all’aria per 10 min ne
determina la morte.
Sono rari nelle infezioni umane.
Fanno parte della componente batterica normale dell’uomo (es. Clostridium
haemolitycum, Treponema denticola, Peptostreptococcus spp., Peptococcus spp.)
• Moderati: tollerano concentrazioni di O2 dal 2 all’8% (in media il 3%) e piu’ di 10 min
di esposizione all’aria.
Sono comuni nelle infezioni umane (es: Bacteroides fragilis, Prevotella spp,
Porphyromonas spp, Fusobacterium nucleatum, Clostridium perfrigens)
Anaerobi aerotolleranti
Crescono bene in anaerobiosi ma anche se vengono incubati in atmosfera ambiente o
con il 5-10% di CO2 (crescita scarsa)
Microaerofili
Necessitano di O2 come accettore finale di elettroni. Non crescono a concentrazioni di
O2 >21%. La miscela ottimale per la loro crescita e’: 5% di O2, 10% di CO2, 85% di N2
(Campylobacter jejuni)
Anaerobi facoltativi
In aerobiosi → l’accettore finale di elettroni e’ l’O2; in anaerobiosi → reaz. di
fermentazione
Tolleranza all’ossigeno
Sembra che la diversa tolleranza all’ossigeno dipenda da
diversi fattori:
velocità con cui le cellule batteriche captano O2;
velocità con cui differenti batteri elaborano prodotti tossici
dall’O2 (radicali idrossilici liberi: OH- e superossidi: O2-);
produzione di catalasi, perossidasi, superossido dismutasi,
vari enzimi che proteggono i batteri dai prodotti tossici dell’O2.
E’ importante l’impiego di grandi inoculi batterici che
diminuiscono l’effetto tossico dell’O2
Batteri anaerobi presenti nella normale flora umana
Cavità orale e vie aeree superiori
Porphyromonas spp., Prevotella spp. (P. oralis), Bacteroides (B . ureolyticus),
Fusobacterium (F. nucleatum), Peptostreptococcus spp., Veillonella spp.,
Tannerella spp., Actinomyces spp., Propionibacterium spp.
Stomaco
Lattobacilli
Intestino tenue
Streptococchi, lattobacilli
Intestino crasso
Bacteroides fragilis, Porphyromonas spp., Fusobacterium spp., Clostridium spp.,
Eubacterium spp. Bifidobacterium spp., Propionibacterium spp., Cocchi anaerobi
Tratto genitourinario, vagina e cervice
Prevotella spp., Porphyromonas spp., Bacteroides spp., Peptostretocccus spp.,
Clostridium spp., Veilonella spp., Latobacillus spp., Eubacterium spp.,
Propionibacterium spp.
Uretra
Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Fusobacterium
spp.,
Pelle
Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp.
Infezione da anaerobi di origine esogena
Botulismo da alimenti
Botulismo neonatale
Clostridium botulinum
Botulismo da ferite
Gastroenteriti
Clostridium perfrigens
Gangrena gassosa
Clostridi
Tetano
Clostridium tetani
Cellulite crepitante
C. perfrigens, Bacteroides, Peptostreptococcus
Infezioni superficiali benigne
Infezioni a seguito di morsi da animali o da uomo
Peptostreptococcus, Fusobacterium
Aborto settico
Bacteroides, Peptococcus,
Infezioni da anaerobi di origine endogena
Ascessi a qualsiasi organo
Diarree e coliti associate a terapia antibiotica
Polmoniti da aspirazione
Complicazioni di appendiciti e colecistiti
Celluliti crepitanti e non
Mionecrosi da clostridi
Infezioni dentali e parodontali
Endocarditi
Meningiti in seguito ad ascessi cerebrali
Polmoniti necrotizzanti
Osteomieliti
Otiti medie
Peritoniti
Artriti settiche
Sinusiti
Materiale patologico
• Tamponi faringei o nasali
• Tamponi gengivali
• Escreato o materiale da broncoscopia
• Succo gastrico, succo duodenale, feci, tamponi rettali, fistole coloncutanee, colonstomie (con questi materiali si può fare diagnosi di botulismo e
di colite sostenute da C. difficile)
• Superfici di ulcere da decubito, tamponi effettuati su pareti di ascessi o da
lesioni mucose
• Campioni diversi dai precedenti, prelevati da cute o membrane mucose
senza una adeguata disinfezione
• Urine
• Tamponi vaginali o cervicali
Isolamento di batteri anaerobi da materiale patologico
E’ necessario curare con attenzione alcuni passaggi:
• Selezione: liquidi organici non urinari, essudati da ascessi profondi,
aspirati transtracheali o polmonari, biopsie di tessuti
• Prelievo: Preferire l’uso di aghi e siringhe, evitare l’uso di tamponi,
decontaminare la superficie per i campioni da mucosa o da cute, emocolture
• Trasporto: Proteggere i campioni dall’esposizione all’ossigeno ed inviare
al più presto i campioni al laboratorio
Isolamento di batteri anaerobi
Sistemi in anaerobiosi per la coltivazione dei batteri anaerobi:
 Giara: viene rimosso l’O2 dal contenitore mediante reazione con l’H2
aggiunto al sistema in presenza di un catalizzatore.
2 H2 + O2 catalizzatore
2H2O
Le condizioni anaerobiche vengono determinate:
-mediante un generatore di H2/CO2 (in busta)
- mediante svuotamento/sostituzione con miscela (85% N2, 10%H2, 5% CO2)
L’indicatore del potenziale redox è il blu di metilene (ambiente ridotto:
bianco)
Come catalizzatori sono usati granuli di allumina
 Cappe per anaerobi:
Sistema sigillato dotato di aperture con guanti che permette di eseguire le
operazioni di isolamento ed identificazione al di fuori dal contatto con l’aria,
che viene sostituita con N2 o da una miscela di N2/H2/CO2
Incubazione delle colture
Temperatura: 35-37°C
Tempo di incubazione: almeno 48 ore, preferibilmente 72-96 ore e oltre.
Actinomyces e Eubacterium spp: crescono lentamente e muoiono se le
piastre vengono aperte prima.
Se si sospettano necrosi sostenute da Clostridi bastano 6-12 ore di
incubazione
Caratterizzazione dei batteri anaerobi
Comportamento all’ossigeno
Caratteristiche delle colonie: colore (eventuale pigmento), densità, consistenza.
Dimensioni delle colonie
Pigmento
Emolisi
Erosione del terreno
Colorazione di Gram
Aspetto microscopico
Spore
Motilità
Crescita in terreno liquido
Esami biochimici
Prodotti metabolici (gas cromatografia)
Sensibilità agli antibiotici
Esami sierologici
Tossicità, neutralizzazione della tossina, patogenicità negli animali
Elettroforesi delle proteine solubili
Isolamento di batteri anaerobi
Esame diretto dei materiali patologici
Caratteristiche della presenza di anaerobi
 Odore sgradevole
 Aspetto purulento dei campioni liquidi
 Presenza di tessuto necrotico, gas
Esame microscopico
 Colorazione di Gram
Test immunologici (per la ricerca diretta di antigeni di batteri anaerobi)
 Immunofluorescenza diretta (anticorpi specifici coniugati con fluoresceina)
Difetti: bassa specificità
falsi positivi
bassa sensibilità
falsi negativi
reazioni crociate
• Sieroneutralizzazione (antisieri specifici in grado di inibire la citotossina di C. difficile)
• CDT latex agglutination = reazione con glutammato deidrogenasi di C. difficile)
• Sistemi immunoenzimatici = in grado di evidenziare in C. difficile:
la tossina A (enterotossina)
la tossina B (citotossina)
• Marker dell’antigammaglobulina: enzima che reagisce con numerose molecole di substrato
reazione
colorimetrica
Gas cromatografia (GLC)
• Ricerca anaerobi in essudati e liquidi biologici; valida se associata ad un esame microscopico diretto del
campione.
Es.: Fusobacterium
es. microsc. = bacilli Gram –
GLC = grandi quantità di acido butirrico
Es.: Bacteroides
es. microsc. = bacilli Gram –
GLC = grandi quantità di acido succinico
Terreni di isolamento
Agar sangue: Trypticase soy agar (L-cisteina, estratto di lievito) Vitamina K1, 5% di
sangue. Terreno non selettivo
L’aggiunta di L-cisteina permette la crescita di batteri che necessitano di aminoacidi
con zolfo, come Fusobacterium necroforum o streptococchi tiolo-dipendenti.
Agar sangue + Kanamicina + Vancomicina: Isolamento selettivo di bacilli anaerobi
Gram-negativi
Terreno al tioglicolato arricchito con emina e Vit. K1: è un brodo di arricchimento che
può essere utilizzato per arricchire i terreni solidi se il campione è particolarmente
scarso.
E’ consigliabile, prima dell’uso, tenere le piastre 4-6 ore in un contenitore per
anaerobiosi o in atmosfera anaerobica
Microsistemi pronti all’uso
API 20A e Minitek: 24H di incubazione. Lettura mediante indice analitico basato su
profili numerici.
Limiti: Incapacità di identificare cocchi anaerobi e bacilli anaerobi Gram-positivi
asporigeni; numero insufficiente di test differenziali per la caratterizzazione e
l’identificazione di batteri anaerobi asaccarolitici.
Kit Rapidi (4h di incubazione in aerobiosi)
Si basa sull’inoculo di substrati particolari con sospensioni dense per rilevare
“enzimi preformativi” (ADS-RapID ANA II System, ATB 32A)
Reazioni utili non determinabili con questi sistemi:
tolleranza all’ossigeno, aspetto delle colonie, reazioni su agar-sangue, colorazione
di Gram, caratteristiche morfologiche, aspetto in terreno liquido, attività lipasica e
lecitinasica su tuorlo, crescita in presenza di bile, riduzione di nitrati.
Determinazione dei prodotti metabolici mediante gas cromatografia
Si basa sulla identificazione dei batteri anaerobi e di numerosi aerobi facoltativi
mediante la determinazione dei prodotti metabolici riversati da questi batteri nei terreni
liquidi durante la crescita anaerobica.
Vantaggi : - velocità di identificazione
accuratezza di identificazione
poco costo
facile esecuzione
La definizione dei generi batterici in base alle vie metaboliche ha acquistato credito
scientifico perché le vie metaboliche rappresentano dei caratteri geneticamente stabili e
conservati.
Numerosi batteri vengono definiti sulla base di un unico prodotto metabolico:
es: Propionibacterium
Ac. propionico
Clostridium butyrricum
Ac. butirrico + CO2 +H2
Bacilli anaerobi Gram-negativi asporigeni
In passato circa 50 specie venivano classificate nel genere Bacteroides. Attualmente
vengono classificati i seguenti generi:
• Porphyromonas bacilli pigmentati non fermentanti il saccarosio, non idrolizzano
l’esculina, non sensibili ai sali biliari.
• Prevotella bacilli sia pigmentati che non pigmentati, fermentanti il saccarosio,
sensibili ai sali biliari, idrolisi all’esculina +/- in relazione alla specie.
• Bacteroides bacilli pleomorfi, fermentanti il saccarosio (produzione di ac. acetico e
ac. succinico) resistenti ai sali biliari, idrolizzano l’esculina.
•Sono presenti 8 generi, di cui 50 specie colonizzano il corpo umano: cavo orale,
intestino, uretra, apparato genitale.
• Tannerella forsythia bacilli immobili, pleiomorfi a lenta crescita (più di 14 giorni)
favorita dalla presenza di acido N-acetilmuramico o di Fusobacterium nucleatum. A
localizzazione sopra- e sottogengivale il cui isolamento è strettamente correlato alla
profondità della tasca. Responsabile di parodontite nell’uomo e negli animali induce
morte cellulare per apoptosi. Invade le cellule epiteliali. L’endotossina e la produzione
di acidi grassi sono considerati fattori di virulenza.
Altri solo occasionalmente possono essere patogeni per l’uomo come Campylobacter
rectus (parodontopatie)
Sindromi cliniche
Parodontopatie: Prevotella, Tannerella, Porphyromonas, Fusobacterium
Infezioni respiratorie: Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Bacteroides non
fragilis
Ascessi cerebrali: Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas (spesso polimicrobici:
cocchi aerobi + Peptostreptococcus)
Infezioni intra-addominali: B. fragilis, Fusobacterium (spesso polimicrobici: cocchi
aerobi + Peptostreptococcus)
Infezioni della pelle e dei tessuti molli: B. fragilis
Batteriemie (5% anaerobi): B. fragilis, Fusobacterium
Infezioni genitali: B. fragilis
Terapia e profilassi
Terapia antibiotica combinata con l’intervento chirurgico.
Molti ceppi sono produttori di beta-lattamasi che li rendono resistenti a penicilline e
cefalosporine. La resistenza alla clindamicina è sempre più frequente tra i
Bacteroides, per i quali l’antibiotico d’elezione è il metronidazolo.
Visto che questi batteri fanno parte della normale componente microbica è
impossibile controllare la malattia, ma se vengono danneggiate le barriere intorno alle
superfici mucose è indicato un trattamento profilattico.
Gruppo Bacteroides
Caratteristiche microscopiche
Bastoncelli Gram-negativi con estremità arrotondate
Le cellule provenienti da brodocolture possono essere pleomorfe con vacuoli
Immobili
Molti ceppi sono capsulati
Caratteristiche colturali
Morfologia delle colonie: 1-4 mm di diametro, non emolitiche, grigie, semiopache, a
margini interi, spesso con strutture ad anello in superficie
Resistenza: penicillina, kanamicina
Sensibilità: rifampicina
Saccarolitici: i pattern di fermentazione dei carboidrati, insieme all’indolo,
permettono la distinzione tra le specie
Resistenza ai sali biliari
Bacilli anaerobi Gram-negativi pigmentati
Porphyromonas ssp(12 specie)
Le specie responsabili di infezioni nell’uomo sono:
P. gingivalis e P. endontalis
cavo orale
parodontopatie
P. asaccharolitica
altri siti
ascessi cerebrali, infezioni urogenitali
Sono tutte e tre pigmentate, asaccarolitiche, catalasi negative
Le altre specie non hanno importanza clinica nell’uomo ma alcune isolate dalla cavità
orale di alcuni animali (P. canoris, P. circumdentaria, P. macacae) possono causare
infezioni in ferite da morsi da animale.
Caratteristiche microscopiche: coccobacilli o corti bastoncelli GramCaratteristiche colturali: (agar sangue per anaerobi)
-Pigmentazione: da giallo-marrone a nere dopo 3-5 giorni di incubazione
-Fluorescenza: rosso-mattone (U.V. a onda lunga = 365nm)
-Resistenza: kanamicina
-Sensibilità: rifampicina, penicillina se non producono beta-lattamasi
-produzione di indolo
-asaccarolitici
Colorazione di Gram
Colonie di P. gingivalis su agar AS
Meccanismi patogenetici di P. gingivalis
Meccanismi di adesione
P. gingivalis mostra la capacità di interagire e legarsi a tutti i componenti della cavità
orale: altri batteri, componenti salivari e proteine della matrice extracellulare.
I componenti che mediano l’adesione di P. gingivalis sono fimbrie, proteasi e vescicole.
Meccanismi di internalizzazione
L’internalizzazione di P. gingivalis nelle cellule epiteliali è correlata con la presenza della
fimbria maggiore. P. gingivalis si lega, ed inizia ad essere circondata dai microvilli della
cellula ospite, e l’internalizzazione avviene per endocitosi mediata da recettori.
Bacilli anaerobi Gram-negativi pigmentati
Prevotella
Le specie responsabili di infezione nell’uomo sono:
P. melaninogenica, P. corporis (B. melaninogenicus sub. intermedius), P. denticola, P.
intermedia, P. nigrescens
Queste, isolate dal cavo orale, possono causare:
- infezioni delle basse vie respiratorie
-infezioni urogenitali
-Parodontopatie
-ascessi cerebrali (raramente)
Caratteristiche microscopiche:
Corti bastoncelli Gram- negativi
Caratteristiche colturali:
-Pigmentazione: tardiva (da 2 giorni a 3 settimane), colonie a marrone a nere (P.
intermedia, P. nigrescens)
Saccarolitici
La identificazione delle diverse specie pigmentate è fastidiosa perché richiedono
tempi lunghi di incubazione, fino a 3 settimane per evidenziare la pigmentazione.
Bacilli Gram- negativi anaerobi asporigeni
Fusobacterium
Presenti normalmente nel tratto gastrointestinale, genito-urinario, nelle alte vie
respiratorie e nel cavo orale, possono causare serie infezioni in diversi distretti
corporei (batteriemie, inf. pleuropolmonari)
Si differenziano dalle specie Prevotella, Porphyromonas e Bacteroides perché il
principale prodotto metabolico è l’acido butirrico.
Le specie più comunemente isolate dal materiale patologico sono:
F. nucleatum e F. necrophorum
Caratteristiche microscopiche
Cellule fusate con l‘aspetto di filamenti sottili con estremità appuntite e talvolta
rigonfiamenti sferici.
Caratteristiche colturali
Colonie di 1- 2 mm di diametro, convesse,con margini irregolari ed opalescenza
maculata. Spesso inattivo biochimicamente.
Entrambe le specie sono indolo +, esculina + ma si differenziano per la lipasi
(+ F. necrophorum, - F. nucleatum).
Meccanismi patogenetici di F. nucleatum
Meccanismi di invasione
F. nucleatum aderisce alle cellule epiteliali orali umane, al collageno, ai fibroblasti
gengivali e ai leucociti polimorfonucleati.
Il LPS di F. nucleatum gioca un ruolo nell’adesione all’epitelio ed alla superficie dentale.
Coaggregazione batterica
La coaggregazione è definita come il riconoscimento e l’adesione di batteri
geneticamente distinti, ed è un processo altamente specifico che comprende
l’interazione di adesine batteriche e recettori. Differenti componenti di superficie
(carboidrati, fibrille, fimbrie e proteine di membrana) possono partecipare alle reazioni di
coaggregazione. La coaggregazione è un fenomeno prevalente tra i batteri isolati dal
cavo orale dell’uomo ed i fusobatteri agiscono come ponte tra i primi e gli ultimi
colonizzatori.
Infezioni orofaringe
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Fusobacterium nucleatum
Infezioni polmonari
Bacilli anaerobi Gram- positivi asporigeni
Sono un gruppo eterogeneo di batteri che colonizzano pelle e superfici mucose. Di
interesse clinico:
Actinomyces (A. israelii)
Bifidobacterium
Eubacterium (E. lentum: ferite e ascessi)
Propionibacterium (P. acnes: endocarditi, inf. SNC)
Identificazione
L’esame colturale non è valido perché la morfologia delle cellule varia in base al
terreno ed alle condizioni di crescita quindi possono essere confusi con altri anaerobi
(Clostridium, Lactobacillus).
Anche la colorazione di Gram non dà informazioni chiare in quanto colonie giovani
possono assumere l’aspetto di cocchi, alcuni peptostreptococchi possono assumere
l’aspetto di bacilli, colonie vecchie possono risultare Gram-negative, alcuni Clostridi da
colture vecchie non presentano spore.
Quindi per l’identificazione dei bacilli Gram positivi anaerobi sporigeni è di grande
aiuto l’uso della GAS-CROMATOGRAFIA.
Actinomyces spp.
Sono microrganismi anaerobi facoltativi, crescono lentamente in coltura e tendono a
causare infezioni croniche.
Caratteristiche microscopiche: In coltura assumono forme filamentose, dette ife,
simili a quelle dei funghi (da qui il nome).
Caratteristiche colturali: Le colonie macroscopiche sono chiamate “granuli di zolfo”,
per il loro aspetto, e sono formate da microrganismi filamentosi legati insieme da
fosfato di calcio. Sul terreno di coltura le colonie appaiono bianche, con superficie a
cupola irregolare (molare).
Habitat: Colonizzano il tratto respiratorio superiore, il tratto gastrointestinale, il tratto
genitale femminile.
Patologia: Hanno un basso potenziale di virulenza e causano malattia solo quando le
barriere mucose sono lesionate da traumi, interventi chirurgici o infezioni. La malattia
più comune è l’actinomicosi, caratterizzata da ascessi multipli, mentre le malattie
parodontali sono più rare. Le actinomicosi sono classificate in base agli organi
coinvolti in:
- Inf. cervicofacciali
- Inf. pelviche
- Inf. toraciche
- Inf. SNC
Diagnosi: va effettuata su una grande quantità di tessuto o di pus, e mira alla ricerca
e all’eventuale osservazione dei granuli di zolfo e di bacilli Gram-positivi filamentosi e
ramificati.
Terapia: Drenaggio chirurgico del tessuto + somministrazione
Cocchi anaerobi
I cocchi anaerobi occupano il secondo posto (dopo i bacilli anaerobi Gram-negativi)
nelle infezioni umane da anaerobi.
Si possono isolare da:
emocolture
liquidi biologici
campioni da ferite e ascessi
Le specie più frequentemente coinvolte sono:
Cocchi Gram-positivi
Peptostreptococcus (anaerobius, asaccharoliticus, magnus, micros)
Peptococcus niger
Streptococcus (S. intermedius, S. morbillorum)
Staphylococcus saccharolyticus
Cocchi Gram-negativi
Veillonella parvula
Acidominococcus fermentans
Megasphaera elsdenii
Principali meccanismi di antibiotico-resistenza
dei batteri anaerobi
Antibiotici
Meccanismi di resistenza
Inattivazione enzimatica (beta-lattamasi)
BETA-LATTAMICI
Diminuita permeabilità
Alterazione del sito bersaglio (PBPs)
Carbapenemici
(metallo-beta-lattamasi)
MACROLIDI
Alterazione del sito bersaglio (resistenza MLS)
CLINDAMICINA
(metilazione subunità 23S rRNA)
METRONIDAZOLO
Alterata permeabilità
Alterazione dei siti bersaglio
CHINOLONI
(girasi e topoisomerasi IV)
Pompe d’efflusso