Metodi in Neuroscienze II
In base a ciò che ci si prefigge di studiare
diventa molto importante la scelta del
preparato (modello animale e/o cellulare)
e del suo grado di complessità
Cervello isolato
Cervello intero isolato di porcellino d’india
Studi effettuati:
- anatomici
- immunoistochimici
- vascolari
- farmacologici
- elettrofisiologici
Vantaggi
Svantaggi:
rispetto alla slice:
- Circuiti corticali interamente preservati
- possibilità di registrare artefatti
- registrazioni intra- ed extracellulari ma solo
in current-clamp
Esempi di probes a multielettrodi utilizzati per la
registrazione contemporanea da diversi strati di tessuto
Probe al silicio a 16 canali
Probe al silicio a 32 canali
50 µm
750 µm
1550 µm
Registrazione dalla corteccia con un probe multielectrode
Slices
Sezione di cervelletto
Preparazione di una slice di ippocampo
Registrazioni Extra- ed Intracellulari
in una Slice di Ippocampo
elettrodo di registr.
intracellulare
stimolo
elettrodo di registr.
extracellulare
stimolo
Whole-cell Patch Clamp in
slice o fettina di tessuto sottile
Neuroni isolati
• Dissociazione acuta di neuroni da tessuto adulto o embrionale
• Colture primarie (da embrione)
Vantaggi rispetto alla slice:
Soprattuto per indagini
elettrofisiologiche
- migliori voltage- e space-clamp;
- migliore farmacologia;
- possibilità di mantenere le
cellule in coltura per giorni;
Linee cellulari stabilizzate
di origine neuronale e non
vantaggi
Biologia Molecolare
Clonaggio ed espressione di geni
Mutagenesi sito-diretta
Biochimica
Biologia Molecolare
Transfez.
Plasmide +
cDNA
NG108-15
SHSY-5Y
HEK
Elettofisiologia
whole-cell
Elettrofisiologia
Clone esprimente
stabilmente il
gene transfettato
&
single-chann.
Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali
ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e
biologi molecolari
Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una
particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel
processo di apertura/chiusura.
Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico
Gene (DNA)
Ipotesi circa una
importante catena laterale
RNA
Viene fatta
“esprimere” la
proteina con una
catena laterale
alterata
Vengono mutati i codons desiderati
o cDNA
misura
Lab 1
Lab2
Lab 3
Lab 4
Linee cellulari
Slices
dissociazione acuta
Colture primarie
Patch-clamp
Linee cellulari
Patch-clamp
