BIOTECH - Atuttascuola

Le biotecnologie
Prof. Elisa Prearo
LST 2007/2008
Tradizionali
Innovative
 Fermentazioni
 Selezione artificiale di
animali e piante
 Ingegneria genetica
(DNA ricombinante)
 Clonazione
 Cellule staminali
 Terapia genica
 OGM agricoli e animali
 Bioremediation
Ingegneria genetica
Ingegneria
genetica
Utilizza la tecnica del DNA ricombinante:
 isolo brevi segmenti di materiale genetico di interesse mediante
gli enzimi di restrizione o con la transcrittasi inversa
 li moltiplico
 ne studio la sequenza nucleotidica
 li trasferisco nel genoma dell’ospite
 ne controllo l’incorporazione e l’espressione nel DNA
dell’ospite
DNA RICOMBINANTE
 Le nuove tecnologie partono da esperimenti effettuati su
batteri e virus intorno al 1975
 Successivamente si scoprì che i geni si spostano
naturalmente da una posizione all’altra del cromosoma
 Tratti di DNA prelevati da fonti diverse vengono
modificati, ricombinati e poi inseriti in altre cellule dove
verranno espressi
 Batteri e virus sono attualmente i principali vettori per
trasferire geni
PLASMIDE
 Elemento genetico extranucleare formato da un DNA
(contiene da 2 a 20 geni) che si replica
autonomamente rispetto al cromosoma dell’ospite
 Circolari ed autoduplicanti, possono essere presenti
anche in più copie
 Spesso portano geni particolari
Plasmide F e Plasmide R
Plasmide F: identificato in E. coli contiene 25 geni,
alcuni per la produzione di pili, strutture proteiche a
forma di bastoncino.
Plasmide R: contiene geni per la resistenza ai farmaci.
Sintesi di enzimi che distruggono il farmaco o ne
riducono gli effetti
Duplicazione a “cerchio rotante”
F+
F-
Coniugazione
Trasferimento di materiale
genetico (plasmide)
mediante contatto cellula
(donatrice) – cellula
(ricevente)
F+
F+
Duplicazione a
“cerchio rotante”
Alla fine della
coniugazione
entrambe le
cellule
possiedono il
plasmide
I VIRUS
 Non si sa se considerarli vivi o no. Sono
costituiti da un CAPSIDE proteico e
all’interno hanno un acido nucleico.
 Infettano solo le cellule dotate di recettori per
le proteine del capside
 Privi di dispositivi metabolici, sono parassiti
obbligati
 Posseggono i geni per “lisare” (demolire) la
cellula ospite. Ma non sempre lo fanno
CICLO LITICO E LISOGENO
Ciclo lisogeno: batteriofagi temperati o profagi. Assomigliano ai plasmidi
Il DNA del virus si integra con quello dell’ospite e questo si replica normalmente
Trasduzione batterica
 Trasferimento di DNA
batterico da una cellula ad
un’altra per mezzo di un
virus
 Generalizzata (frammenti a
caso) e specializzata
(trasportano un segmento
preciso)
Trasduzione specializzata: il
batteriofago lambda
 Temperato. Può trasportare i geni dell’operone
lattosio e rendere una cellula batterica in grado
di utilizzare il lattosio come nutriente.
Assomiglia alla coniugazione ma il vettore del
DNA è un virus
Virus nelle cellule eucariote
 Alcuni virus possono essere integrati ne DNA degli
eucarioti: i PROVIRUS quando sono integrati
 Provirus a DNA e virus a RNA o retrovirus
 Virus s DNA: possono iniziare un ciclo litico o integrarsi
 Retrovirus: possiedono un enzima nel capside, la
transcrittasi inversa, che passa nell’ospite insieme al
RNA del virus. Qui copia l’RNA virale, ottenendo un
DNA complementare; da esso si origina poi dopo molti
passaggi un DNA a doppio filamento, che viene
successivamente integrato nel DNA dell’ospite.
 Non sempre i provirus provocano danni, possono però
interferire con l’espressione genica dell’ospite
Fago
Virus dell’influenza
Virus HIV
Trasposoni




Segmenti di DNA che sono in grado di “saltare” da una zona
all’altra del cromosoma. Sono caratterizzati da un gene che
codifica per la trasposasi, che catalizza l’inserzione in un
nuovo sito. La copia non comporta la scomparsa dal sito di
partenza. Nei procarioti e negli eucarioti
Semplici: corti e solo i geni necessari alla trasposizione.
Identificabili perché provocano mutazioni
Complessi: portano più geni e sono individuabili perché
esprimono i loro geni.
I geni per la resistenza ai farmaci sono trasposoni e così si spiega
la velocità della loro propagazione.
I trasposoni degli eucarioti sono simili, ma molti prima sono
copiati in RNA, poi ancora in DNA prima di essere trasposti.
DNA ricombinante
 Ingegneria genetica. In molti casi si utilizzano i
plasmidi, i virus e i trasposoni. Scopi: ottenere piccoli
segmenti di DNA, sequenziarli ed identificarne i geni
specifici. Non necessariamente nell’ordine: dipende
dallo scopo della ricerca
 Per ottenere delle sequenze di DNA di interresse
utilizzo gli enzimi di restrizione che sono in grado di
tagliare il DNA tra basi contigue precise
Come ottenere piccoli frammenti: gli
enzimi di restrizione
 L’enzima di restrizione è un particolare tipo di endonucleasi che è in
grado di riconoscere specifiche sequenze di basi lungo il filamento di
Dna, e di "tagliare" esattamente in corrispondenza di queste
sequenze.
 Gli enzimi di restrizione sono ritenuti essere una sorta di sistema
immunitario dei batteri. Essi attaccano solamente il DNA esterno, ad
esempio di un virus, perché il DNA dei batteri presenta una
metilazione, che lo rende inattaccabile dai propri enzimi
 La caratteristica che rende importanti questi enzimi per lo studio del
DNA è che ognuno di essi riconosce, lega e taglia il DNA in una
sequenza ben precisa detta sequenza di riconoscimento. Ad esempio,
EcoRI (isolato da Escherichia coli) riconosce la sequenza GAATTC,
mentre BamHI (isolato da Bacillus amyloliquefaciens H) la sequenza
GGATCC.
La sequenza di
nucleotidi staccati
viene detta “sticky”
(appiccicosa) o
estremità coesiva,
che può riattaccarsi
spontaneamente
mediante legami
idrogeno. L’enzima
DNA-ligasi completa
la ricucitura.
Ricombinazione
 Il fatto importante è che le estremità coesive
complementari possono appaiarsi con altri
segmenti di DNA tagliati dallo stesso
enzima di restrizione.
 Il DNA di qualsiasi vivente può essere
ridotto in piccoli frammenti e manipolato. I
frammenti possono essere separati con
l’elettroforesi su gel ed analizzati
Come ottenere copie multiple
Clonazione di DNA
 Si isola il DNA che si vuole prendere in esame e un plasmide
 si tagliano entrambi con lo stesso enzima di restrizione che
crea estremità coesive sia nel DNA che nel plasmide,
 il segmento di DNA viene mescolato col plasmide tagliato. Le
estremità coesive del plasmide si appaiano con quelle delle
estremità complementari del frammento di DNA di interesse
 l’enzima DNA-ligasi unisce le due molecole di DNA.
 Il risultato è un plasmide ricombinante.
 Tale plasmide viene quindi inserito in un batterio.
 A questo punto ha inizio l’effettiva clonazione del gene. Il
batterio, con il suo plasmide ricombinante inizia a riprodursi
La PCR è una tecnica che prevede l’amplificazione di
una sequenza specifica di DNA
Ingredienti:
 Sequenza da amplificare
 NTP : nucleotidi, come ATP, CTP, GTP, TTP)
 Primers (inneschi): sequenze complementari agli
estremi 5’ e 3’ del segmento da riprodurre
 TAQ polimerasi: una DNA-polimerasi estratta dal
batterio termofilo Termus aquaticus per la reazione di
allungamento
La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi:
1. nella prima abbiamo la denaturazione del DNA, fase
che avviene ad alte temperature, circa 94 °C
2. una fase di annealing, appaiamento, in cui i primer si
appaiano ai filamenti complementari che avviene a 5060 °C
3. una fase di extension, in cui la TAQ polimerizza
usando come stampo la sequenza specifica, che
avviene a circa 70°C
 Queste fasi vengono ripetute circa 20 – 30 volte in
modo da avere circa 1.000.000 di copie
Kary Mullis – premio Nobel 1993
per la chimica
CycleSequencing.zip
Reazione a catena della polimerasi.zip
30 SECONDI
94°C
30 SECONDI
50-60°C
QUALCHE MIN 72°C
STRUMENTO IN GRADO DI
VARIARE CICLICAMENTE LA
TEMPERATURA IN MODO
AUTOMATICO
TRA LE VARIE FASI DI OGNI
CICLO DI PCR
Le reazioni nel termociclatore
Sequenziamento
Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in zone specifiche, i frammenti creati da
diversi enzimi di restrizione dello stesso tratto di DNA possono essere sovrapposti e
ricomposti come un puzzle.
Possono essere marcati con fluorescina già durante la PCR e letti poi da un
sequenziatore che si avvale di un software specifico.
Il sequenziatore si avvale di un microcapillare che permette di determinare la sequenza
nucleotidica di un frammento di DNA mediante rilevazione della fluorescenza. Dopo la
migrazione elettroforetica, il campione colpito da una sorgente luminosa (laser ad
Argon) emette una fluorescenza che viene rivelata da un sensore. Il segnale elaborato
da un opportuno software mostra in forma grafica a quattro colori la sequenza del DNA
in esame. La marcatura, che avviene nel corso di una P.C.R. lineare, permette di
marcare il DNA sia in 5' (utilizzando primer marcati ) sia al 3' (utilizzando terminatori
marcati). Il risultato di questa reazione produrrà dei frammenti di DNA, nei quali le
differenti basi (G, A, T, C) saranno identificate da quattro diversi colori. Ciascun
colorante reagisce alla luce emettendo una propria fluorescenza, ciò permette di correre
le quattro reazioni come se fossero un unico campione.