Clonaggio-elettrof_.07

Amplificazione DNA
• Clonaggio
• PCR
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
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sito di restrizione
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Gli enzimi di restrizione possono generare
diversi tipi di estremità
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Uso degli enzimi di restrizione
•Clonaggio
•Mappa di restrizione
•Polimorfismi di restrizione (RFLP)
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Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
Vettori di clonaggio
Plasmidi
Virus
Trasposoni
Minicromosomi artificiali
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Vettori plasmidici
Elementi di un vettore plasmidico
1. Origine di replicazione
2. Marcatore di selezione
3. Sito di restrizione unico
Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
Preparazione del DNA da clonare
Digestione clone già esistente
DNA specifico
PCR
frammentato con
enzimi di restriz.
Frammento di DNA genomico
che può contenere regioni
trascritte o non trascritte
frammentazione
Collezione DNA
(banca, genoteca) cDNA:
meccanica
DNA ottenuto per
trascrizione inversa dell’mRNA,
che quindi contiene tutto o parte
di una regione trascritta
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RNA
PREPARAZIONE
del cDNA
DNA
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Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare
mediante ligasi di estremità coesive
VETTORE
GAATTC
CTTAAG
AATTC
G
G
CTTAA
EcoRI
DNA ligasi
AATTC
G
G
CTTAA
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
INSERTO
Unione, mediante ligasi,
di estremità coesive create da un enzima di restrizione
VETTORE
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
G
CTTAA
AATTC
G
AATTC
G
G
CTTAA
GAATTC
CTTAAG
DNA ligasi
GAATTC
CTTAAG
INSERTO
Reazione di ligasi
• strategie
• controlli
Clonaggio con singola digestione
trattamento del vettore con fosfatasi
pAATTC
G
G
CTTAAp
AATTC
G
G
CTTAA
fosfatasi
DNA ligasi
pAATTC
G
G
CTTAAp
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII
GAATTC AAGCTT
CTTAAG TTCGAA
AGCTT
G
A
CTTAA
DNA ligasi
AATTC
G
A
TTCGA
EcoRI
HindIII
GAATTC
CTTAAG
AAGCTT
TTCGAA
Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
Introduzione del DNA nella cellula ospite
Trasformazione: CaCl2
Elettroporazione
In E.coli
Impacchettamento e infezione fagica
Trasfezione (transiente o stabile):
Calcio fosfato
Liposomi
In cellule di
eucarioti superiori
Elettroporazione
Microiniezione
DNA gun
Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
Vettori plasmidici
Strategie di selezione nel clonaggio
resistenza
AMPICILLINA
AMPICILLINA
Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
SacI
1200 bp
EcoRI
Isolamento acidi nucleici
1. lisi cellulare
2. deproteinizzazione
3. concentrazione
Purificazione acidi nucleici
• Deproteinizzazione:
agenti enzimatici
solventi organici
• Precipitazione:
cationi +
etanolo
(Na, NH4)
isopropanolo
Purificazione acidi nucleici
Purificazione acidi nucleici
Isolamento DNA plasmidico
• Protocollo “artigianale”
• Colonnine cromatografiche (kit
commerciali)
Protocollo artigianale
Risospensione delle cellule in
tampone con RNasi
Lisi cellulare con NaOH/SDS
Neutralizzazione con Kacetato
(precipitazione di proteine)
Estrazione fenolo/cloroformio
Precipitazione con isopropanolo
Risospensione in TE
Analisi acidi nucleici
• Spettrofotometro (quantitativa)
• Elettroforesi su gel (qualitativa,
semiquantitativa)
Spettro di assorbimento del DNA
1.5
Assorbanza
(OD)
1 OD260=50g/ml
1.0
OD260/OD280=1,8-2,0
0.5
220 240 260 280 300 320
lunghezza d’onda (nm)
Elettroforesi di acidi nucleici
• Gel di agarosio
• Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
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Migrazione del DNA su gel
Le molecole lineari di dsDNA
migrano a velocità
inversamente proporzionali
al logaritmo in base 10 del
numero di paia di basi.
Fattori che influenzano la migrazione
• Peso molecolare
• Concentrazione di agarosio
• Conformazione DNA
• Voltaggio applicato
• Intercalanti
• Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare
HindIII
ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2006/2007
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel
di agarosio:
1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate
2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio
Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione
3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione
Analisi spettrofotometrica del DNA preparato
4) Analisi della digestione su gel di agarosio
Discussione dei risultati
SacI
1200 bp
EcoRI
Metodi di lisi cellulare
Tecnica
Applicazione
Metodi non meccanici
Shock osmotico
Tessuti animali molli, alcune cellule
vegetali
Congelamento/scongelamento
Tessuti animali molli, alcuni batteri
Enzimi litici
Cellule animali e vegetali
Detergenti (NP40, SDS)
Cellule in coltura, batteri
Metodi meccanici
Pestello e mortaio
Tessuti resistenti
Sfere di vetro
Batteri e funghi
Omogenizzatore a motore
Tessuti vegetali e animali
Omogenizzatore a mano
Tessuti molli delicati
Estrusione solida (Hughes press)
Materiale vegetale resistente
Estrusione liquida (French press)
Microorganismi
Ultrasonicazione
Microorganismi
Vettori procariotici
naturali
Col E1
pSC101
artificiali
pBR322
pUC8
pEMBL8
Plasmidi
Fagi
Cosmidi
lambda
M13