Inoculo di batteri fitopatogeni: AT

Laboratorio n° 6:
I batteri fitopatogeni
Indice della lezione
Sezione teorica
1.1. Sintomi dei batteri fitopatogeni
1.2. Tecniche di inoculo dei batteri fitopatogeni
1.3. I patogeni oggetto della lezione: Pseudomonas savastanoi (PS),
Agrobacterium tumefaciens (AT)
Attività di laboratorio
3.1. Coltivazione e trasferimento dei batteri
3.2. Preparazione delle sospensioni batteriche
3.3. Preparazione dell’inoculo di PS e AT
3.4. Inoculo con PS
3.5. Inoculo con AT
Differenze tra funghi e batteri
 I batteri fitopatogeni:
- organismi procarioti
- le cellule batteriche sono di dimensioni inferiori (1-4 micron) alle spore
fungine
- molti batteri fitopatogeni sono parassiti facoltativi, quindi sono facilmente
coltivabili su substrati agarizzati
- Circa 30 generi di batteri producono circa 300 malattie delle piante
- Richiedono, rispetto ai funghi, la presenza di un continuo “film” liquido
sulle superfici per svilupparsi e diffondersi
- I batteri vengono indicati con la consueta classificazione latina binomiale
a cui si può aggiungere la “pathovar” (pv). Questa è utilizzata per
indicare batteri di una stessa specie che attaccano specifiche specie
vegetali
Differenze tra funghi e batteri
Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni
Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni
 Ralstonia
vascolare
solanacearum
(appassimento)
–
patogeno
Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni
 Erwinia amylovora (colpo di fuoco delle pomacee) – emissione di
mucillagini costituite da enzimi extracellulari e cellule batteriche
“ooze”
Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni:
tumori
Pseudomonas savastanoi
Agrobacterium tumefaciens
Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni:
macchie fogliari
 Pseudomonas syringae pv. tomato (Macchiettatura batterica del
pomodoro).
 Rispetto ai funghi, le macchie fogliari dovuti ai batteri sono più irregolari e
“angolari” in relazione alla morfologia della foglia, in quanto i batteri hanno maggiori
difficoltà nel superare ostacoli fisici (venature). Spesso le macchie fogliari sono
idropiche (water-soaking) a causa della distruzione enzimatica dei tessuti vegetali
Coltivazione e inoculo di batteri fitopatogeni
 Comunemente vengono utilizzate cellule vive dei patogeni.
Questo richiede che la colonia di partenza sia “rinnovata” con
frequenza.
 Rinnovo delle colonie batteriche:
- rinnovo attraverso “scrisciamento” su substrato NAG
- tecnica finalizzata a “diluire” in piastra la popolazione
batterica fino ad ottenere colonie singole
Isolamento di batteri fitopatogeni (1:2)
 Isolamento da fusti infetti:
- Fusti di olivo presumibilmente attaccati da Pseudomonas
savastanoi (rogna dell’olivo)
 Sintomi e segni osservabili:
- Tumori
Inoculo di batteri fitopatogeni: AT
 Agrobacterium tumefaciens (AT)
agente causale del tumore batterico
Inoculo di batteri fitopatogeni: AT
 TIPI DI INOCULO: 1_Sospensione di cellule batterice inoculate
nel fusto
Isolamento di batteri fitopatogeni (2:2)
 Inoculo in foglie di tabacco dei batteri isolati da tumori
 Reazione di ipersensibilità:
- La reazione di ipersensibilità (HR) è un meccanismo utilizzato dalle piante per
prevenire e limitare la diffusione di infezioni duvute a patogeni. HR è
caratterizzata dalla rapida morte delle cellule coinvolte nell’infezione. La morte
cellulare è legata all’accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS).
L’identificazione dei batteri
Il sistema Biolog permette una rapida identificazione
di oltre 2,500 specie di batteri aerobici e anaerobici,
lieviti ed alcuni funghi.
Il sistema su basa sull’analisi di profili metabolici
delle specie microbiche.
Piastra da 96 pozzetti “caricata”
con differenti substrati organici.
L’attività microbica determina
l’ossidazione del substrato con
sviluppo di colore viola
Lettura automatica del profilo funzionale
e identificazione della specie attraverso
confronto con banca dati
Attività di laboratorio
Computo dei materiali e attività
 Preparazione e quantificazione dell’inoculo batterico:
- selezionare delle colonie batteriche
- prelevare parte della colonia con un’ansa sterile
- “stemperare” la colonia batterica in un tubo con acqua sterile
- quantificazione della colonia batterica attraverso lettura dell’assorbanza ottica
allo spettrofotometro (lunghezza d’onda 530 nm)
- calcolo della concentrazione batterica attraverso confronto del valore rilevato
allo spettrofotometro con la retta di taratura. La retta è stata precedentemente
ottenuta attraverso diluizione seriali e conte su substrato.
- diluire la sospensione batterica fino alla concentrazione desiderata
- applicazione della sospensione batterica sul materiale vegetale
 Inoculo delle sospensioni batteriche (1 x 105; 1 x 106; 1 x 107) su foglie di
tabacco mediante infiltrazione con siringa
 Inoculo di sospensioni batteriche (1 x 107) nel fusto di piante di
pomodoro mediante infiltrazione con siringa