enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione
La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo
svizzero, insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith. Nel 1978 i tre ricevettero
il Premio Nobel in medicina per "per la scoperta degli enzimi di restrizione e la loro
applicazione a problemi di genetica molecolare".
Ciascun enzima
di classe II
possiede una
propria sequenza
bersaglio (detta
anche sequenza
consenso), che
riconosce e
taglia. Questa
sequenza,
solitamente di 48 paia di basi, è
detta sito di
restrizione e
permette di
tagliare il DNA a
livello di quel sito.
• Plasmide
ingegnerizzato
Sequenziamento
Sequenziamento
DNA
del genoma
Determinazione dell’ordine dei
nucleotidi nel Dna dell’organismo
METODO SANGER
Nucleotidi Terminator
di-dedossi-Nucleotidi-Trifosfati
Si amplifica un frammento di DNA
Si denatura il DNA e si lavora su 1
emielica
Si sceglie un Primer radioattivo a
sequenze nota e DNA Polimenrasi
4 provette con i 4 nucleotidi + un
solo tipo di ddNTP (concentrazione
1/100)
Caricamento e corsa elettroforetica
per separare i frammenti
Metodo Sanger
L’elettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare,
identificare e purificare frammenti di DNA.
Il gel può essere costituito da agarosio se i frammenti sono di poche
centinaia di pb..
Esso, se fuso e gelificato, forma una matrice, la cui porosità dipende dalla
concentrazione dell’ agarosio.
La molecola del DNA è caricata
negativamente e, quindi, in un campo
elettrico migrerà verso il polo positivo.
La matrice porosa del gel ritarda la
migrazione del DNA, consentendo ai
piccoli frammenti di spostarsi più
velocemente rispetto ai più grandi. Il
risultato è che i frammenti di DNA si
separeranno nella matrice in funzione
del peso molecolare
Dna Finger printing
Trasformazione batterica
Trasformazione batterica
Piastre con terreno selettivo
per selezionare batteri trasformati
LB
LB+
ampicillina
LB+ ampicillina
LB+
ampicillina+
arabinosio