1999 Lee Bardwell

Siamo tutti diversi
• In media due persone
differiscono in 1 ogni 1000
coppie di basi
1
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Polimorfismo
Differenza genetica
relativamente comune in
una popolazione
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Nota:
Una persona puo’ avere solo
1 o 2 alleli di un
particolare gene.
In una popolazione, ci
possono essere molti alleli
diversi di un particolare
gene
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Qualche tipo di
polimorfismo
•
•
•
•
Alleli
RFLP- restriction fragment length p…
SNP- single nucleotide p…
Tandem repeat p…
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RFLPs
restriction fragment length polymorphisms
Polimorfismi che alterano la lunghezza dei
frammenti di restrizione
Risultano da:
• cambiamenti (e.g. SNPs) che introducono o
alterano un sito di restrizione
• differenze nel numero di copie di un Tandem
Repeats (TRPs)
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H&J Fig. 4.19
H&J Fig. 4.20
Come trovare differenze in due
campioni di DNA…
• Sequenziare i due campioni
– Poco pratico
– Necessita’ di grosse quantita’ di DNA
• Cariotipo
– Rivela solo grossi cambiamenti
• Delezioni molto grandi, trisomie, etc.
• Cercare RFLPs o TRPs usando dei marker
– Miglior metodo attualmente disponibile
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Gel Elettroforesi
• L’elettroforesi separa il DNA in base alle
dimensioni
• DNA migra verso il polo positivo
• Le molecole piu’ grandi si muovono piu’
lentamente
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Visualizzare il DNA
• DNA si visualizza con molecole che
lo legano (bromuro d’etidio)
• Metodi usati per visualizzare piccole
quantita’ di DNA specifico:
– Southern blot
– Polymerase chain reaction (PCR)
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Southern Blot - I
• DNA tagliato con enzimi di
restrizione
• DNA separato con elettroforesi
• DNA trasferito su filtro e
denaturato
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Southern Blot - II
• Il filtro e’ mescolato con una sonda
radioattiva (a singolo filamento)
complementare alla sequenza da rivelare
• ibridazione = si formano legami idrogeno
fra basi complementari
• DNA ibridato con la sonda e’ rivelato con
una lastra fotografica
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Un plasmide 5 kb, 2 siti EcoRI
E
* *
*
*
plasmid
probe
E
Cut with
EcoRI
--> gel
--> blot
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Stained X-ray
gel
film
campione di DNA
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cromosoma
GAATTC
CTTAAG
* *
sonda
*
GAATTC
CTTAAG
*
3 kb
GAATTC
CTTAAG
2 kb
Cut with EcoRI restriction enzyme
Gel--> blot
Altre ~ 750,000 bande non si vedono perche’
non ibridizzano con la sonda
X-ray film
H&J Fig. 6.27
Read H&J section 6.6 & 6.7
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Usa primer (oligonucleotidi) che
fiancheggiano la regione di interesse
• Cicli ripetuti di polimerizzazione risultano
in una amplificazione esponenziale della
regione di interesse
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Risultato…
del Southern blot o della PCR
– Rivelazione di una o poche
bande in un background di
molte migliaia di bande
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Campione di DNA
Reazione di PCR
Elettroforesi
H&J Fig. 4.21
Figlio
Madre
Padre x
Padre y
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Crime scene
Sample:
Victim + perp
Suspects
Victim
AJ
OJ
DJ
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Due reazioni di PCR
Per due zone diverse sul DNA
L’individuo donatore di
questo DNA e’ eterozigote
per tutti e due i siti di DNA
Primers 1
Primers 2
Cercare un legame tra un
polimorfismo ed una malattia
• Analizzare ogni membro della
famiglia per un polimorfismo ed il
fenotipo della malattia
• Trovare un polimorfismo che si
associa sempre con il fenotipo della
malattia
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Marker
Una piccola (200-1000 bp) regione di
DNA di un particolare cromosoma
Marker non
collegati
Marker collegato
50
cM
{
Marker strettamente
collegato
Gene della Fibrosi Cistica
Chrm 7
Chrm 1
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H&J Fig. 4.24 plus autosomal dominant disease
Supports linkage of disease to marker
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H&J Fig. 4.24 plus autosomal dominant disease
Does not support linkage of disease to marker
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• Una volta trovato un marker
strettamente collegato si identificano le
mutazioni nel gene candidato che devono
essere presenti solo negli individui
affetti dalla malattia
• examples: Cystic fibrosis,
Huntington’s disease, Neurofibromatosis
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