produzione di farmaci ricombinanti in cellule procariotiche

PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI
- Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus)
- Insetti vivi (sistema di espressione: virus patogeni specifici)
- Cellule di mammifero in coltura
- Animali vivi come bioreattori (pharming)
INGEGNERIA GENETICA NEGLI ANIMALI
Transgenesi: tecnologia del trasferimento genico per introdurre sequenze di
DNA nel genoma di cellule animali (o vegetali)
- Creazione di linee cellulari transgeniche
- Creazione di animali transgenici (contengono il gene clonato in tutte le loro cellule)
Scopi:
- Produzione di proteine ricombinanti a scopo farmacologico (anche da animali vivi:
pharming)
- Creazione di modelli animali per malattie umane
- Ingegnerizzazione di cellule umane per la terapia genica in vivo o ex vivo
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE
DI MAMMIFERO
1) Trasferimento genico diretto:
- trasfezione mediata da liposomi
- trasfezione mediata da recettori
- trasfezione DNA libero con microiniezione nel nucleo
2) Trasferimento tramite vettori
- plasmidici
- virali (trasduzione)
3) Tipi di Inserzione:
- ectopica
- mirata
4) Obiettivi:
- Produzione di proteine e farmaci
- Inserzione geni in cellule specifiche per creazione animali transgenici
- Terapia genica somatica nell’uomo
Trasferimento genico diretto
Trasfezione (per endocitosi) mediata da liposomi anionici o cationici
Analogo sintetico del doppio
strato fosfolipidico di
membrana
DNA trasportato nell’interno
DNA trasportato all’esterno
Trasferimento genico diretto
Trasfezione (per endocitosi) mediata da recettori
Esempio:utilizzo recettore TfR
Trasferimento genico diretto
Trasfezione DNA libero con microiniezione
Inserzione di più copie di DNA lineare
Trasferimento genico tramite vettori virali
Virus a DNA o ad RNA
Obiettivo
Introdurre e pilotare l’espressione di transgeni in cellule in coltura
Espressione
-Transitoria per transgeni non integrati nel genoma ospite, elevata
espressione ma necessario trattamento ripetuto
- Stabile ma ridotta per transgeni integrati
Svantaggi
- Possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in
maniera casuale nel genoma)
- Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate
- Tecniche con bassa efficienza e costi elevati
Trasferimento genico tramite vettori virali
Sistema vettoriale
Ospite e
localizzazione
Considerazioni
SV40
Vari mammiferi può
o meno integrarsi
Adenovirus
(virus raffreddore)
Vari mammiferi, di
solito episomico
Inserto fino a 8 kb,
elevato livello
espressione
Virus adeno-associati
Vari mammiferi, si
integra siti specifici
cromosoma 19
Inserto fino a 4,5
kb, necessita di
adenovirus per
packaging
Papillomavirus
(cancro del collo
uterino)
Vari mammiferi,
integrazione stabile
Inserzione DNA di
buone dimensioni
Elevato livello
espressione
Retrovirus
Ampia gamma, si
integra come cDNA
Dimensioni fino a
8,5 kb
Trasferimento genico tramite vettori virali
Siti di clonaggio
Genoma 5,2 kb
Promotore costitutivo forte
Eliminazione di alcuni geni virali per inserire
DNA esogeno
Adatto a molti tipi cellulari
Alta efficienza espressione transiente
Limitazioni inserto per permettere packaging
Trasferimento genico tramite vettori virali
Svantaggi
•
•
•
•
Virus non integrati: espressione transiente
Virus integrati: espressione stabile, possibile mutagenesi inserzionale (per
quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)
Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate
Tecniche con bassa efficienza e costi elevati
PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI
Produzione proteine umane in grandi quantità sostituisce la purificazione da:
- organi o tessuti animali di proteine animali a volte poco efficaci o con effetti
allergici o contaminanti;
- organi e tessuti umani (sangue o organi di cadaveri); es. purificazione ormoni
della crescita da ipofisi e rischio di malattia Creutzfeld-Jacob
- Produzione in batteri
- Produzioni in eucarioti microbici
- Produzioni in cellule animali
vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche
svantaggi: colture costose (supporto solido per la crescita, densità minime, uso
di vettori virali e possibili conseguenze nella co-purificazione)
- Produzioni in animali e piante transgenici = pharming (pharmacological e
farming)
vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche
PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN
CELLULE PROCARIOTICHE, EUCARIOTICHE O
PHARMING
PRODOTTO
MALATTIA
Insulina
Diabete
Somatostatina
Disordini della crescita, acromegalia,
nanismo
Somatotrofina
Disordini della crescita, acromegalia,
nanismo
Fattore VIII
Emofilia A
Interferone (vari)
Leucemia e altri tumori
Fattore di crescita
epidermide
Ulcere
Fattore di crescita
fibroblasti
Ulcere
Eritropoietina
Anemia
Attivatore tissutale
plasminogeno
Infarto
PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN
CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA
Molecola piccola
non glicosilata, ponti
disolfuro
Proteina di fusione: pochi aa della galattosidasi di E. coli seguiti dalla
metionina
Formazione del legame disolfuro inefficiente!
Cambiata la sintesi (vedi diapo successiva)
PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN
CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA
Dopo ripiegamento spontaneo
Tagli proteolitici eliminano
il leader e il segmento C
PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN
CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOSTATINA
Molto piccola:
solo 14 aa = 42 bp
aa della -galattosidasi
di E. coli seguiti dalla
metionina
PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN
CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOTROFINA
Proteina grande: 191 aa
Estrazione di mRNA ipofisario,
produzione cDNA,
Sito di taglio per HaeIII
inserimento leader sintetico,
clonaggio, trasformazione,
produzione proteina
Leader sintetico: codoni 1-24
sostituiti (stessi aa) per corretta
traduzione (propensione del
codice) in E. coli
PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI
MAMMIFERO: IL FATTORE VIII
Produzione in E. coli impossibile
26 esoni e 25 introni
2351 aa
Proteina dimerica: subunità A e C
con17 legami disolfuro e molti siti
glicosilati
Necessari 17 legami disolfuro e
glicosilazione: tentativi di produzione in
E. coli ma proteina non attiva!
PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI
MAMMIFERO: IL FATTORE VIII
I 2 cDNA per subunità A e subunità C clonati in 2 vettori di espressione plasmidici
separati.
Promotore Ag: ibrido sequenza -actina di pollo e -globina di coniglio
Plasmidi introdotti in linea cellulare di hamster
Produzione efficiente e proteina attiva
FVIII prodotto anche tramite pharming (secreta come proteina del latte nel maiale)
PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI
USATI COME BIOREATTORI
Sistema
Specie
Prodotto
Latte
Maiale
Fattore VIII
Topo
Attivatore plasminogeno tissutale umano
Ormone della crescita umana
Fibrinogeno umano
Coniglio
Eritropoietina umana
Pecora
1-antitripisina umana
Fattore IX
Capra
Attivatore plasminogeno tissutale umano
Siero (sangue)
Coniglio
1-antitripisina umana
Urine
Topo
Ormone della crescita umana
CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI
1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di
una cellula appena fecondata.
Se l’inserimento genico riesce, tutto l’animale che ne deriva è trangenico
(comprese cellule germinali)
2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita
fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata.
Tutto l’animale che ne deriva è trangenico
3) Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto
in blastocisti di madre surrogata
L’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule
germinali hanno il transgene)
A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con
specificità tissutali
CLONAGGIO NELLE CELLULE DI MAMMIFERO
CON MICROINIEZIONE NEL NUCLEO
Trasferimento genico mediante microiniezione nel nucleo (pronucleo
maschile)
Microiniezione di plasmidi batterici con DNA gene da inserire
Microiniezione di copie di DNA lineare (privo di vettore)
Inserimento nel DNA cromosomico di copie multiple in tandem
Utilizzo: permettono la produzione di animali transgenici quali modello di malattie
Svantaggi:
Scarsa efficienza di integrazione
Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale
Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
Stimolazione dell’ovulazione in una femmina
Appena dopo l’accoppiamento microiniezione di DNA
con il transgene (circa 200 copie) iniettato all’interno del
pronucleo maschile (fatto su 20-30 ovuli fecondati)
Gli ovuli microiniettati vengono impiantati nell’utero di
una madre adottiva resa pseudogravida da maschio
vasectomizzato. Dopo 3 settimane: progenie e analisi.
L’animale è transgenico perché il transgene è
presente in tutte le cellule
Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
Oocita fecondato
Accoppiate con
maschi
vasectomizzati
Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo
maschile
LA GHIANDOLA MAMMARIA COME BIOREATTORE
- Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore
- Produce fino a 10g/l di proteina transgenica
- Una pecora produce 250-280 litri ogni ciclo di lattazione
- E’ più economico dei comuni fermentatori
- Produce corrette modificazioni post-traduzionali
- Facile la purificazione (nel latte ci sono poche proteine)
Clonaggio a monte
di un promotore espresso
nella ghiandola mammaria
(caseina, beta-lattoglobulina)
PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI
USATI COME BIOREATTORI
Produzione di Fattore VIII umano nel latte del maiale.
Il cDNA umano completo a valle del promotore del gene della proteina
acida del siero del latte di maiale.
Sintesi di fattore VIII nel tessuto mammario del maiale e secrezione della
proteina nel latte
Problematiche:
- Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione
nei pronuclei (in genere non più del 5% degli oociti iniettati dà progenie
transgenica.
- Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali
- Invecchiamento prematuro degli animali
- Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).
Tecnologia del trasferimento nucleare
Riprogrammazione del
nucleo che ripercorrerà
l’intero sviluppo
Tecnologia del trasferimento nucleare
Clonazione animale:
creazione di Dolly
Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997)
Problematiche della clonazione animale:
- Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare
- Alta frequenza di malattie congenite negli animali
- Invecchiamento prematuro degli animali
- Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).
Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in
blastocisti
Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne
della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo l’accoppiamento.
Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il
differenziamento: totipotenti
Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e
capacità differenziative limitati)
Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in
blastocisti
NO è una CHIMERA!!!
Zigote
Mutazione genetica
Zigote 1(blastocisti)
Zigote 2 (cellule ES)
due popolazioni cellulari
Mosaico
due popolazioni cellulari
Chimera
Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in
blastocisti
Solo alcuni topi produrranno gameti con il transgene che daranno topi transgenici
Efficienza del trasferimento genico
Meno del 5% della
prole è transgenica
Problematiche:
- Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione
nei pronuclei.
- Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali
- Invecchiamento prematuro degli animali
- Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).