Organismi Transgenici
- Alterazione del genoma tramite tecniche di manipolazione
del DNA
- Metodo diverso rispetto all’induzione di mutazioni
- Le mutazioni indotte avvengono in maniera random
- Prime prove di organismi transgenici :
inserzione di un elemento esogeno nel genoma
- Preparazione di costrutti adatti per essere attivi in genomi di
origine diversa,
Nei genomi eucariotici non esistono unità autonome
autoreplicanti come i plasmidi nei batteri. Perché?
Meiosi e mitosi vogliono strutture cromosomiche con centromero
Topi transgenici per
espressione e knock-out
Inserzione random
Ricombinaz. omologa (cellule ES)
Embrioni tetraploidi
Costrutti con BAC
Mutanti condizionali
Espressione inducibile
Topi transgenici per inserzione
random nel genoma
Primi topi transgenici solo di espressione di
marcatori, geni eterologhi, sovrannumerari,
- iniezione diretta del DNA nella blastocisti
- inserzione in una o più copie nel genoma ospite,
- inizialmente un marcatore carrier per il colore del mantello
Metodologia di base
- organismo transgenico
Come si ottiene: trasfezione batterica come modello
Trasfettare cellule eucariotiche animali e vegetali col DNA
Tecnica del DNA ricombinante per i vettori
Cellule vegetali hanno anche la parete di cellulosa: metodi di
trasfezione più complessi
Cellule animali hanno solo la membrana meno resistente
Tecniche di trasfezione diverse e con efficienze diverse
Necessità della tecnica adeguata per veicolare il DNA
Modelli transgenici
Animali modello:
drosofila, coenorabditis, xenopus,
topo
Essenziale è avere la finestra in cui intervenire nel processo di
sviluppo dell’animale
Nel topo si riesce ad isolare la blastocisti
Tutto il lavoro preliminare era stato fatto dagli embriologi
Cellule ES
Blastocisti di topo
Blastocisti al Microscopio elettronico
Procedura per topi transgenici
Da cosa dipende l’efficienza di espressione del transgene:
- sito di inserzione
-numero di copie che si inseriscono nel genoma
- Il controllo dell’ integrazione con Southern o con PCR.
- Con PCR inversa per trovare il punto in cui si è inserito.
- L’espressione si verifica con la tecnica adatta per determinare
il fenotipo.
- Si usane anche geni reporter.
Topi transgenici per knock-out
- ricombinazione omologa in cellule ES
(staminali embrionali totipotenti solo recenti)
- la frequenza di ricombinazione è circa di 10-6.
Le cellule staminali ES si coltivano in vitro e si deve
evitare che differenzino.
- vettore per ricombinazione omologa ha regioni di
omologia al sito in cui deve ricombinare ed un gene per
la selezione con un antibiotico
- elettroporazione del vettore nelle cellule staminali.
Vettori per ricombinazione omologa
Struttura ad
- costrutti ad con la parte esterna (le spalle) con l’omologia al
gene “target” da mutagenizzare,
- nella parte interna è presente un gene per la selezione con un
antibiotico per cellule di mammifero (neomicina) ed anche un
gene reporter ( gal, GFP ecc.).
- L’inserzione provoca la mutagenesi del gene endogeno che se
è letale non darà origine ad un topo transgenico. L’espressione
dei geni per la resistenza ad antibiotici o dei geni reporter deve
essere controllata da promotori costitutivi o inducibili per poter
fare la selezione delle cellule ricombinanti.
(prova con i geni Hprt e tk timidino-kinasi. I mutati danno la sensibilita’ al
terreno HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt
produce resistenza alla 6-thioguanina).
esperimenti di ricombinazione omologa di Capecchi
Knock-out del gene per la resistenza HGPRT ipoxantina-guanina
fosforibosil transferasi.
Il problema e’ di selezionare le cellule con un fenotipo, ma sono pochi
i geni con un fenotipo selettivo, in tale assenza spesso si utilizza la res.
per un antibiotico.
Il costrutto per far avvenire la ricombinazione omologa deve avere una
regione omologa a quella con cui vogliamo ottenere la ricombinazione:
mut.
w.t.
vettore a struttura
- costrutto con due regioni di omologia (spalle) rispetto alla regione
interna che si vuole inserire.
La frequenza e’ stata studiata ed e’ ~ 1- 2 x10 -6
Per studiare la ricombinazione nel topo ci vorrebbero milioni di topi per 1 ricombinante
invece in una fiaschetta si coltivano molti milioni di cellule: circa 106 / ml
Mutanti condizionali
Il sistema cre-lox
Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox
e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che
perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre.
Si devono costruire dei vettori con la regione genetica da
eliminare con siti Lox all’esterno (introni) e si chiamano floxed.
Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per
geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con
l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far
avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si
esprime o dove si induce Cre.
Topi transgenici mutanti condizionali
Il limite principale dei topi transgenici knock-out per un gene e’la
possibile mortalita’ degli omozigoti durante lo sviluppo.
- una soluzione per questo problema potrebbe essere l’induzione della
mutazione tempo e tessuto specifica
- e’ stato applicato il sistema di ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox
utilizzato anche in biologia cellulare perche’ inducibile
- Cre e’ la ricombinasi (causa ricombinazione) e LoxP (locus di crossover
in P1), serve per mantenere una sola copia del genoma, evita i multimeri
- i siti Lox sono costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione centrale
di 8bp
- la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamento tra due strutture Lox
allineate originando delezione se sono in tandem, inversione se sono in
palindrome, duplicazione se sono su cromatidi fratelli e integrazione se
c’e’ un elemento in un plasmide ed un altro nella sequenza dove si
integra (vedi fig. 1)
inversion
intramolecular deletion
a
b
a
c
tandem
a
c
palindrome
c
a
b
a
b
d
c
b
c
scambio su cromat. fratelli
a
a
a
c
c
b
b
c
intramolecular deletion / duplication
a
b
integration
c
- Questa tecnologia e’ applicata alle cellule staminali di topo ES.
- L’inserzione dei siti LoxP si deve far avvenire tramite gene-targeting
con un costrutto specifico (i costrutti con i geni con le regioni
fiancheggianti che contengono siti LoxP si chiamano “floxed”)
- quando si esprime il gene Cre avviene la ricombinazione e se si esprime
solo in un tessuto la mutazione diventa tessuto specifica e si puo’ seguire
il destino delle cellule che lo vanno a formare, per esempio nelle cellule
pancreatiche quelle che formeranno le cell. a e
- l’espressione del gene Cre non sempre e’ omogenea nel tessuto e la
ricombinazione avviene a mosaico non nel 100% delle cellule
- come controllo si usano due geni reporter, per cui se si ha
ricombinazione il primo fiancheggiato da due siti Lox (lacZ) si inattiva e
si attiva il secondo gene reporter (di solito la GFP o la fosfatasi alcalina)
L’introduzione delle cassette per la resistenza ed i siti LoxP si fa avvenire
per ricombinazione omologa
Il costrutto per il gene floxed
costrutto
esone x
induz. di Cre
ricombinaz.
e delez. neo
esone y
esone x
introne x
loxP - neo - loxP
neo
esone x introne x
loxP
esone z
gene tk
loxP
loxP - neo - loxP
ricombinaz.
omologa
costrutto
ricomb.
introne x
esone z
esone y
gene tk
loxP
esone y
esone z
loxP
gene tk
Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule
sensibili al Ganciclovir
Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato
e le cellule potranno essere eliminate con la selezione dell’antibiotico
Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del
gene Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle
blasocisti
Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al
momento giusto e nel posto giusto
Ci sono linee di topi transgenici che esprimono Cre nelle cellule
epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC o altri sistemi
Sono state fatte proteine di fusione con il dominio mutato di legame al
ligando (ligand binding domain LBD) dell’ormone degli estrogeni, in
modo che la ricombinasi sia confinata nel citoplasma finche’ non viene
somministrato l’ormone sintetico che riconosce il recettore e fa
traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove
induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP
(vedi esempio della figura precedente)
Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici con “Gene Targeting”
sito e tempo specifici.
(Methods 24 , 2001, pag 71-80) D.Metzger e P. Chambon
- Il Gene targeting ha alcune limitazioni per l’assenza della funzione del
gene colpito da mutazione (targetet) che durante le fasi di sviluppo puo’
risultare letale precludendo lo studio di funzioni possibili negli stadi
iniziali e successivi a quello letale.
- Inoltre molti geni svolgono funzioni multiple in vari tipi di cellule
durante l’ontogenesi e fase postnatale (pleiotropici), questo provoca
fenotipi complessi e complica l’individuazione di cellule anomale
prodotte da fenomeni con piu’ cause.
- E ancora, l’effetto di una mutazione puo’ essere compensata durante lo
sviluppo mascherando il fenotipo alterato nell’animale adulto. Nel caso
di famiglie di geni si devono mutare piu’ geni della stessa famiglia per
prevenire la ridondanza funzionale di espressione che preclude
l’identificazione di una funzione di un componente di quella famiglia
genica.
- Definire una funzione di un gene membro di una famiglia puo’ essere
ancora piu’ complicato quando la famiglia e’ coinvolta in un sistema
pleiotropico di un pathway di segnali come i recettori per l’acido
retinoico o FGF.
- Altri effetti confondenti il knock-out di un gene possono essere il
rischio di danno sulla fertilita’e disordini sistemici.
- In tutti questi casi sara’ problematico determinare la funzione di un
gene in una frazione di cellule ad un certo momento della vita del topo.
- inoltre nel caso di modelli animali di patologie umane con mutazioni
somatiche come il cancro
- Quindi la necessita’ di avere un metodo con l’inattivazione
condizionale di un gene e’ molto forte
Sono state sviluppate strategie per avere gene-targeting condizionale in
topo basato su cellule tessuto-specifico o espressione inducibile sito
specifica del gene della ricombinasi CRE del fago P1.
Ligand Inducible Cre Recombinase
L’attivita’ di molti enzimi (oncoproteins, fattori di trascriz., RNA-binding prot., kinasi) puo’
essere controllata in maniera dipendente dal Ligando se fusa al dominio
che lega il ligando LBD (ligand binding domain) di un recettore di un ormone
steroideo.
E’ stata fatta una proteina chimerica attiva della ricomb. Cre - LBD del
recettore dell’estrogeno (ER) per cui l’attivita’ della ricombinasi Cre-ER
dipende dalla presenza di 17-estradiol. Per non avere il controllo della
proteina in presenza di estradiolo endogeno:
e’ stato mutato il LBD del recettore ER (Cre-ERT) in maniera da legare
solo un ligando sintetico (tamoxifen =Tam, 4idrossi tamoxifen=OHT) sfruttando la
mutazione nota (Gly 525 Arg). Questo costrutto funziona in cellule in vitro.
-Esperimento di espressione del gene in topo transgenico :
costrutto messo sotto il controllo del promotore/enhancer del gene IE di
CMV (citomegalovirus) il frammento PvuII del costrutto pCMVCre-ERT
iniettato in zigoti F1(C57BL/6XSJL), analisi del transgene da DNA caudale.
Analisi del topo transgenico
Dopo l’analisi del DNA della coda per PCR
Analisi dell’espressione con anticorpi anti CRE, scarsa espressione
eccetto nell’epidermide.
Analisi della presenza dell’ RNA estratto da vari tessuti
Transgene Cre - ERT
PvuII
CMV
promoter 3
globin intron
SV40 polyA signal
inizio trascrizione
INTRON
Cre-ERT
1
poly A
4
2
PvuII
Prova di espressione e funzionamento su un topo transgenico
“floxed” per il gene del recettore dell’acido retinoico a RXR
7
E8
E9
8
RXRa(targetet floxed gene)
5
Tk neo
E8
LoxP
RXRa(targetet floxed gene
Excision of floxed marker
After CRE recombinase)
50
40
30
20
Prodotto di PCR 156 bp
Primers 7 e 8
7
E8
E9
8
E9
6 LoxP
Prodotto di PCR 190 bp
Primers 7 e 8
100
80
60
40
10
20
0
0
mRNA CRE Er %
RXRa wt
Livello di espressione di CRE (pallini) e di excisione dopo 3 giorni e dopo 1 giorno nella coda
Metodo del gene trapping
Per fare topi transgenici su vasta scala
generalizzata, senza un solo target
In realtà il topo transgenico si ottiene solo dopo aver selezionato
la cellula staminale, quindi il vero prodotto è solo la collezione di
cloni di cellule staminali ES mutagenizzate nei diversi geni.
RNA interference (hairpin double strand RNA)
Metodi per interferire con l’espressione di un gene: “stable suppression of
gene expression by RNAi in mammalian cells” P.N.A.S. vol.99 n.3 pp 1443-8 P.J.Paddison et al.
- mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori
- knock out per ricombinazione
- anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore)
- RNA antisenso trascritto da un vettore
- oligo antisenso
Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in
certi casi non sono regolabili. L’RNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in
dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della
interferenza e’ legata al sistema Dicer, cioe’ ad un pathway enzimatico che riduce
l’RNA specifico del messaggero in frammenti.
E’ stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre
un RNA a doppio filamento per bloccare l’enzima Dicer stesso
Soppressione stabile dell’espressione genica
tramite RNA interference in cellule di mammifero
Sistema cellulare di
difesa antivirale
dimerizzazione
PKR
fosforilazione
Blocco non
specifico della
traduzione
EIF2a
(kinasi)
dsRNA
esogeno
(~ 500 bp)
attiva
Cofattore per la ribonucleasi
non - specifica (Rnasi L)
2’- 5’ oligodenilato
polimerasi
pcDNA3
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
ZEO r
Gene per la resistenza alla
zeocina;
L Lox P;
GFP
Le prime 500 bp codificanti di
enhanced gr. fluor. prot. EGFP;
P
Promotore di
citomegalovirus;
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
Ricombinasi CRE
P
GFP
ZEO
r
ZEO
L
GFP
L
r
dsGFP
Rapporto FF:REN
Riduzione di 10 volte dell’espressione di FF in
cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN
FF = firefly luciferase
REN = renilla luciferase
ds = double strand
ss = single strand
as = antisense
