Clonaggio posizionale
Con questo termine si indica l’insieme delle metodiche che
possono essere impiegate per identificare un gene utilizzando
come informazione di partenza solo la sua posizione fisica sul
cromosoma.
Le informazioni sulla posizione del gene possono derivare da:
1. Analisi di linkage
2. Anomalie cromosomiche in alcuni pazienti (delezioni,
traslocazioni)
3. Perdita di eterozigosi per marcatori polimorfici (importante
soprattutto per l’identificazione dei geni oncosoppressori)
Fasi del clonaggio posizionale
1. Prima identificazione della regione cromosomica (di solito
identifica regioni di circa 10 megabasi)
2. Restringimento della regione candidata (per poter procedere
bisogna che il gene sia mappato in una regione di circa una
megabase)
3. Mappaggio e sequenziamento della regione candidata
4. Identificazione dei geni situati nella regione critica, e ricerca
di quelli che presentano anomalie.
5. Conferma del gene
In seguito al sequenziamento dl genoma umano questa
procedura si è semplificata moltissimo, e oggi, dopo aver
mappato il gene, si può in genere procedere direttamente alla
sua identificazione.
Analisi di linkage
Analisi di linkage
Anomalie citogenetiche
Traslocazioni
Delezioni
Perdita di eterozigosi
Cellula normale
Allele
mutato
Cellula affetta
A’
A’’
A’
A’’
B’
B’’
B’
C’’
C’
C’’
C’
Allele
normale
A seguito della delezione la cellula
è diventata apparentemente
omozigote al locus B
Perdita di eterozigosi
La cellula diventa anormale perché un allele era già mutato,
mentre il secondo viene perso a causa della delezione.
A seguito di questa delezione la cellula è diventata
apparentemente omozigote al locus B. Il locus B non è
responsabile della patologia. Tuttavia, se rilevo questo
fenomeno (confrontando il tessuto sano e quello patologico
dello stesso individuo per i diversi marcatori della regione),
capisco che il gene si trova vicino al locus B.
Identificazione del gene della distrofia
muscolare di Duchenne
Identificazione del gene della distrofia
muscolare di Duchenne
1. Malattia a trasmissione X-linked recessiva
2. In genere colpiti i maschi, ma raramente anche le femmine
3. 1/3 dei casi sono nuove mutazioni
4. Gene mappato su Xp21 mediante analisi di linkage già nel
1982 (primo gene ad essere mappato con questo metodo).
5. Prima della identificazione del gene non si aveva alcuna idea
sulle basi biochimiche della patologia.
6. Il lavoro che ha portato alla identificazione di questo gene
(1987) ha costituito il primo banco di prova del clonaggio
posizionale. Due gruppi sono arrivati indipendentemente alla
identificazione del gene, in entrambi i casi usando scorciatoie
rispetto all’approccio classico.
Strategia 1: Clonaggio per sottrazione
In questo caso si è sfruttato un paziente che presentava una
delezione su Xp21 visibile citogeneticamente.
Soggetto normale
Paziente
Strategia 1: Clonaggio per sottrazione
DNA soggetto normale:
Taglio con enzima A
DNA paziente:
Taglio con enzima B
Strategia 1: Clonaggio per sottrazione
Il DNA del soggetto normale vine mescolato con un eccesso di DNA
del paziente e denaturato. La miscela viene poi fatta rinaturare.
Strategia 1: Clonaggio per sottrazione
Situazione dopo rinaturazione
Strategia 1: Clonaggio per sottrazione
Solo le molecole di DNA provenienti dalla regione critica non
ibridizzano con le molecole di DNA del paziente e quindi
mantengono le estremità coesive caratteristiche dell’enzima A
A
A
A
A
A
A
Pertanto queste molecole possono essere inserite
selettivamente in vettori di clonaggio tagliati con l’enzima A. I
risultanti cloni provengono preferenzialmente dalla regione
critica, e possono quindi essere utilizzati per avvicinarsi al gene
Strategia 2: Clonaggio del punto di rottura di
una traslocazione in una femmina affetta
Le femmine sono colpite dalla DM di Duchenne rarissimamente
(circa 20 casi al mondo). Generalmente si tratta di casi sporadici
(senza storia familiare) in cui sono presenti traslocazioni tra
cromosoma X e autosomi.
Strategia 2: Clonaggio del punto di rottura di
una traslocazione in una femmina affetta
Nel caso che ha portato all’isolamento del gene la
paziente presentava una traslocazione tra il cromosoma
X (nella regione Xp21) e il cromosoma 21. La regione
del cromosoma 21 coinvolta era nota contenere un
gruppo di geni codificanti per RNA ribosomiali (circa 50
ripetizioni). Pertanto, per clonare il punto di rottura, la
strategia è stata di produrre una genoteca con il DNA
genomico della paziente (library genomica) e isolare i
cloni che contenevano contemporaneamente geni per
l’RNA ribosomiale, e materiale proveniente dal
cromosoma X.
Entrambi gli approcci hanno portato alla
identificazione dello stesso gene
Si tratta di un gene enorme:
•2,4 milioni di basi
•80 esoni
•Moltissimi prodotti derivanti da
promotori multipli e splicing
alternativo.
•La maggior parte dell mutazioni
sono delezioni
•Lo stesso gene è anche coinvolto
nella distrofia muscolare di Becker
(forma meno grave derivante da
mutazioni meno devastanti).
Fibrosi cistica del pancreas
• Patologia autosomica recessiva, molto frequente
• Anomala viscosità delle secrezioni, che determina chiusura dei dotti
pancreatici (maldigestione) e dei bronchi (polmoniti recidivanti e
bronchiectasie).
• Anomala concentrazione di cloro nelle secrezioni (test del sudore)
Pancreas normale
Pancreas di paziente
Identificazione del gene della fibrosi cistica
• Nel 1985 il gene venne localizzato sul cromosoma 7 grazie al suo
linkage con un marcatore proteico.
• Successivamente fu possibile un mappaggio più fine, che localizzò il
gene in un intervallo di 500 kb tra due marcatori (cMet e D7S8).
• Il DNA di tutta la regione è stato clonato usando le tecniche del
chromosome walking e jumping.
• Il sequenziamento di questi cloni ha permesso di identificare nuovi
marcatori polimorfici, in forte linkage disequilibrium con il gene della
fibrosi cistica. Questo è stato possibile perché la maggior parte
degli alleli mutati nella popolazione non derivano da nuove
mutazioni, ma da un’unica mutazione ancestrale, mantenuta in virtù
del vantaggio dell’eterozigote (gli eterozigoti sono probabilmente
più resistenti del resto della popolazione all’infezione da Salmonella
typhi).
Come si fa a clonare una regione genomica
partendo da una sonda corrispondente ad un punto
per il quale sia dsponibile una sonda molecolare?
Sonda 1 Sonda 2
Sonda 3
Sonda 4
Gene
A
B
C
E
D
F
G
Questa metodica prende il nome di chromosome walking
Camminare e saltare lungo il cromosoma con
diversi tipi di cloni
Marcatore 1
Regione critica
2 Mb
Marcatore 2
Gene malattia
Cloni YAC (1Mb)
Cloni BAC, P1, PAC (100-200 Kb)
Cloni fagici e cosmidici (20-40 Kb)
Camminare e saltare lungo il cromosoma
Linkage disequilibrium
Alleli marcatori
Cromosomi FC
X1, K1
X1, K2
X2, K1
X2, K2
3
147
8
8
A1
X1
A
X
A2
X2
Cromosomi normali
49
19
70
25
FC
K2
B3
K
B
K1
B1
Identificazione del gene della fibrosi cistica
• Il sequenziamento della regione fiancheggiante i marcatori più vicini
al gene della fibrosi cistica permise di identificare il primo esone del
gene.
• Il resto è stato identificato facendo diversi screening di cDNA
libraries.
• Alla fine nei pazienti è stata trovata nel 70% dei casi una mutazione
in omozigosi consistente nella delezione di un codone (F508Del).
• Non è stato facile stabilire che questa mutazione è effettivamente
causa della malattia, poiché si trova nel 3-4% della popolazione
normale. Avrebbe potuto essere un ulteriore polimorfismo
strettamente associato al gene. Tuttavia in seguito sono state
riscontrate altre mutazioni nello stesso gene in altri pazienti.
Identificazione del gene della fibrosi cistica
• Oltre a ciò si è visto che la proteina codificata da questo gene è un
canale di membrana per gli ioni cloro, e che la mutazione disturba la
sua capacità di trasportare ioni.
Identificazione dei geni oncosoppressori
mediante approcci posizionali
• I soggetti predisposti ad alcune forme di cancro sono spesso
portatori di mutazioni in eterozigosi a carico di geni
oncosoppressori
• Una mutazione somatica (ad esempio una delezione) che determini
una inattivazione della seconda copia del gene in una o più cellule
può determinare l’insorgenza del cancro.
• Se la delezione è grande, la si vede anche al microscopio, e questo
può servire per dare le prim indicazioni sulla posizione del gene.
• Se la delezione è piccola, nel tessuto tumorale del paziente si nota
una perdita di eterozigosi per i marcatori associati al gene.
• L’analisi di molti tumori permette di restringere
la regione critica e di mappare finemente la
posizione del gene oncosoppressore
Paziente 1
Paziente 2
Tumore
Sangue
Tumore
Sangue
A’
A’’
A’
A’’
A’’
A’’’
A’’
A’’’
B’
B’’
B’
C’’
B’’
B’
B’’
B’
C’
C’’
C’
C’
C’’’
C’
Genotipo
Genotipo
A’ A’’
B’ B’’
C’ C’’
A’ A’’
B’
C’ C’’
A’’ A’’’
B’ B’’
C’ C’’’
Conclusione: il gene è localizzato tra il locus B e il locus C
A’’ A’’’
B’ B’’
C’
In seguito al sequenziamento del genoma umano non è più necessario
fare tutto il lavoro di mappaggio e sequenziamento delle regioni
critiche. Se identifico la regione critica di un gene malattia la trovo già
mappata e sequenziata, e so anche quali geni sono compresi in essa.
Approccio del gene candidato indipendente
dalla posizione genomica
Si tratta di una situazione abbastanza rara. Il caso più tipico
è quello della identificazione di un gene malattia umano
basata sulle omologie con un modello sperimentale
animale. Se nel modello viene identificato un gene
responsabile di una patologia che ricorda molto una
patologia umana, il gene omologo umano diventa
immediatamente il candidato più forte per quella patologia.
Ovviamente il candidato andrà confermato cercando
mutazioni di quel gene nei pazienti.
Approccio del candidato posizionale
La maggior parte dei geni responsabili di patologie umane sono stati
identificati grazie ad una combinazione di informazioni posizionali e non
posizionali.
Infatti bisogna considerare che:
• Un approccio completamente indipendente dalla posizione funziona
solo raramente, perché molto spesso le basi molecolari delle malattie
sono così complicate che non è possibile fare ipotesi funzionali sensate.
Infatti molto spesso, dopo l’identificazione di un gene-malattia, si è
scoperto che le ipotesi sulla sua funzione erano completamente
sbagliate.
• Un approccio puramente posizionale non è quasi mai efficace, perchè
le regioni candidate in genere contengono decine di geni, e cercare
sistematicamente le mutazioni in tutti è un lavoro troppo grosso.
Pertanto, anche quando si usa il clonaggio posizionale, e importante
utilizzare una serie di altri criteri per identificare i candidati migliori.
Criteri per la definizione di un
candidato posizionale
1. Espressione compatibile con la patologia
2. Funzione appropriata (esempio della rodopsina)
3. Conservazione evolutiva (DRES)
4. Omologia con un gene implicato in un modello animale della malattia
(sindrome di Waardenburg e topo Splotch)
Il sequenziamento del genoma umano e le
nuove tecnologie rendono estremamente più
semplice l’approccio del candidato posizionale
Sindrome di Leigh, tipo Franco-Canadese
1. Patologia piuttosto rara, ma frequente in una particolare area geografica.
2. Degenerazione di alcune aree cerebrali (nuclei della base e tronco dell’encefalo),
associata a episodi ripetuti di acidosi lattica.
3. Deficit di Citocromo c ossidasi
4. La citocromo c ossidasi è un complesso mitocondriale costituito da almeno 30
subunità; il suo assemblaggio è regolato da altre proteine
•
L’analisi di linkage aveva
permesso di restringere la
regione critica in un intervallo di
5 cM sul cromosoma 2.
•
La mappa del genoma ha
permesso immediatamente di
identificare quali geni sono
presenti in questa regione (15
verificati sperimentalmente e 15
predetti da approcci informatici
•
Nessun gene mitocondriale
ovvio tra questi
•
Una analisi di dati di microarray
ha permesso di stabilire che
uno di questi geni (LRPPRC) ha
un profilo di espressione simile
a quello dei geni mitocondriali
noti. Infatti l’analisi dei pazienti
ha evidenziato mutazioni
proprio a carico di questo gene.
Conferma del gene candidato
•
Identificazione di mutazioni nei pazienti (si veda la lezione sulla patologia
molecolare) e analisi della loro segragazione nelle famiglie affette
•
Produzione di un modello sperimentale animale della malattia
mediante inattivazione selettiva (knockout) o overespressione del
gene omologo in animali transgenici.
•
Se possibile, la prova migliore del coinvolgimento diretto di un gene
in una patologia consiste nella restaurazione del fenotipo normale
in un modello cellulare o animale della stessa (saggio di
complementazione).
•
Una volta identificato il gene bisogna capire quali sono i
meccanismi fisiologici in cui è coinvolto e quali sono gli effetti
funzionali delle mutazioni.
