Limonene

Limonene
Il limonene è un metabolita secondario, presente in natura in numerose specie
vegetali, in particolare nella buccia di limoni e agrumi. La molecola appartiene
alla categoria dei composti terpenici, sintetizzati nelle piante in vie metaboliche
complesse a partire dall’unità a cinque atomi di carbonio dell’isoprene.
L’importanza che assume questa molecola è dovuta alla sua correlazione con
la prevenzione nell’insorgenza di alcuni tumori , nonché possedendo spiccate
proprietà antiossidanti, risulta importante nel proteggere le cellule dallo stress
ossidativo e dalle disfunzioni mitocondriali.
In particolare il limonene si è dimostrato efficace nella prevenzione e cura di
tumori alla mammella, cancro alla prostata, tumori del fegato e dello stomaco.
Come si evince dalla figura gli effetti chemopreventivi di composti naturali, di cui
il limonene ne è un buon rappresentante, sono molteplici e diversificati ma tutti
tesi a limitare la proliferazione cellulare o indurre apoptosi delle cellule
cancerose.
Sono stati proposti diversi meccanismi d’azione per il limonene tuttavia essi sono stati
sperimentati solo in vitro, e in vivo solo su modelli murini.
Un primo esperimento (1), teso a dimostrare come il limonene intervenga sulla
crescita e sulla metastatizzazione del tumore allo stomaco, inducendo l’apoptosi delle
stesse cellule tumorali.
Cellule tumorali BGC-823 sono state inoculate per via sottocutanea in topi nudi al fine
di creare la massa tumorale.
D-limonene, puro al 97%, è stato somministrato a diverse concentrazioni a quattro
gruppi randomizzati di topi: un gruppo di controllo, un gruppo trattato con un
chemioterapico (5-FU), un terzo gruppo tratta con il limonene e il quarto gruppo
assumeva una combinazione dei due,per sette settimane.
All’ottava settimana, quando i topi sono stati uccisi, la neoplasia è stata prelevata e
pesata, nonché valutata l’eventuale comparsa di metastasi a distanza.
La tabella successiva mostra i risultati ottenuti
Dai risultati in tabella possiamo subito notare come la massa tumorale, espressa in
grammi, si sia notevolmente ridotta nel gruppo che assunto limonene in forma
assoluta o combinato al chemioterapico, così come è aumentato di almeno sei volte
l’indice apoptotico (AI) rispetto al gruppo di controllo. Ultima considerazione
importante va fatta sulla riduzione del numero di microvasi, segno di ridotta
angiogenesi e di ridotta metastatizzazione, nonché nella ridotta produzione del fattore
di crescita dell’endotelio vasale (VEGF), il quale sostiene il processo di neoangiogenesi
della massa tumorale in crescita.
Un secondo esperimento (2) prende in considerazione l’azione svolta dal metabolita
principale del limonene, l’alcool perillico(POH) e di un suo analogo la perilaldeide (PALD).
In questo studio sono state prese cellule di adenocarcinoma polmonare umano A549 e
una linea cellulare del carcinoma a cellula squamose della lingua , BroTo.
Dall’analisi dei dati si ottengono i seguenti grafici:
Dal grafico possiamo notare come la
vitalità delle cellule , di entrambe le linee
cellulari, sia notevolmente ridotta in
seguito a trattamento con POH e PALD
indicando l’elevato grado di citotossicità
sulle cellule tumorali di entrambi i
metaboliti.
In questi altri grafici, invece il grado
di inibizione della proliferazione
cellulare è rappresentato dalla
capacità di generare colonie da parte
delle linee tumorali, all’aumentare
della concentrazione di POH e PALD.
Questa tabella ci mostra invece, tenendo in considerazione il potere pro-apoptotico dei
metaboliti, la proporzione di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare esposte ai
monoterpeni. Ad esempio nella linea cellulare A549 ad una concentrazione di POH di 1mM
abbiamo l’arresto del 76.7% delle cellule in fase G0/G1 del ciclo cellulare.
POH e PALD quindi, a seconda delle diverse concentrazioni, determinano l’arresto delle
colonie cellulari trasformate in fasi differenti del ciclo cellulare.
Anche da questa serie di grafici
possiamo notare come
all’aumentare della dose dei
monoterpeni somministrati ad altre
cellule tumorali, in questo caso (3)
si trattava di 116 linee cellulari di
carcinoma del colon umano, sia per
alcool perillico che per l’acido
perlillico(AP), si ha l’accumulo di
cellule 116 HCT nella fase G1 del
ciclo cellulare. Questo incremento
è accompagnato a una marcata
diminuzione della percentuale di
cellule in fase S.
Molti studi hanno dimostrato la correlazione tra ciclo cellulare e l’insorgenza del
cancro. Il passaggio attraverso le diverse fasi del ciclo cellulare è governato da un
complesso di proteine chinasi. Ogni complesso è costituito da una subunità
catalitica, cdk, e una proteina associata, ciclina.
La progressione del ciclo nella fase G1 è mediata dall’attività combinata di ciclina
D1/Cdk4,6 e del complesso ciclina E/Cdk2.
In questo immunoblot possiamo invece osservare l’espressione delle diverse proteine
che regolano il ciclo cellulare operanti sul passaggio dalla fase G1 alla fase S.
Possiamo notare, con l’utilizzo di entrambi i monoterpeni , dell’incremento dosedipendente dell’espressione della proteina p21, proteina che gioca un ruolo importante
nella transizione G1/S, e alla conseguente diminuzione della ciclina D1 come già
precedentemente riscontrato.
Anche l’espressione di cdk4 e cdk2 subisce una diminuzione dipendente dalla dose di
terpene somministrata.
In particolare a concentrazioni di POH di 1 mM i livelli della ciclina D1 sono ridotti
dell89%.
In questo studio invece( 4) , utilizzando cellule del cancro alla prostata umano DU-145,
si è voluta indagare l’attività antiproliferativa e proapoptotica dell’impiego terapeutico
del limonene associato ad un comune chemioterapico, il docetaxel.
Come si può vedere dai grafici (A, B), la percentuale di cellule sopravvissute è
notevolmente ridotta sia nel trattamento solo con docetaxel che nel trattamento solo con
limonene. Altresì si può notare come,nel grafico C,l’aumento progressivo della
concentrazione di limonene sia associata alla progressiva riduzione della vitalità cellulare.
Questo studio ha posto l’accento anche sull’effetto pro-apoptotico del limonene sulle
cellule cancerose. Per analizzare l’attività apoptotica, l’espressione di specifiche caspasi
è stata messa in evidenza mediante l’utilizzo di anticorpi monoclonali di topo marcati
con fluorofori.
a) Cellule di controllo
b-e) Cellule trattate
con docetaxel + dlimonene per 6-1224-48 ore
rispettivamente
f) Cellule trattate
con docetaxel
p21 – p53 – BAD – citocromo C
Bcl-xl – PARP
Bad e Bcl-xl appartengono entrambe alla famiglia di proteina Bcl-2, di cui la prima è una
proteina pro-apoptotica, tanto che i suoi livelli aumentano, mentre la seconda è una
proteina anti-apoptotica e di fatto i suoi livelli risultano ridotti.
La proteina PARP è invece un enzima che partecipa ai meccanismi di mantenimento
dell’integrità della cromatina e della riparazione del DNA.
L’ultimo studio (5) che si vuole qui considerare è effettuato su due linee cellulari di
cancro alla mammella umano : KPL-1 e MCF-7. Anche in questo caso il trattamento
è avvenuto con alcool perillico.
PCNA (sliding clamp) funziona come
cofattore della DNA-polimerasi sia nella
fase S che nella sintesi del DNA stesso, è
associata alla riparazione del DNA. Livelli
molto bassi di PCNA si possono osservare in
cellule non replicanti.
Come abbiamo potuto notare, numerose sono le evidenze a sostegno dell’efficacia del
limonene nei confronti della proliferazione cellulare e dell’induzione apoptotica nelle
cellule cancerose.
Tuttavia si rendono necessari ulteriori studi e sforzi affinché tale molecola possa in
futuro, entrare a far parte delle strategie anticancro, con numerosi benefici sulla salute
umana, data la sua tossicità pressochè nulla.