Diagnostica microbiologica
Diagnosi diretta e diagnosi indiretta
•La diagnosi diretta è rivolta alla ricerca dell’agente
infettante o di suoi componenti chiaramente identificati;
•La diagnosi indiretta o sierologica sfrutta a fini
diagnostici la risposta immunitaria dell’organismo
infettato;
•Entrambe possono essere qualitative e quantitative.
Diagnosi
Diagnosi diretta
Diagnosi indiretta
• Trova e identifica l’agente
– isolandolo e
identificandolo
– dimostrando la
presenza di suoi
prodotti specifici
• tossine
• antigeni
• acidi nucleici
• Cerca le prove di una risposta
immunitaria specifica in atto
– ricerca di anticorpi
movimento anticorpale
titolo alto
IgG /IgM, sIgA
scelta tra le svariate
reazioni atg-acp
– valutazione CMI
skin test (Mantoux per tbc)
nuovi test
Diagnosi diretta e diagnosi indiretta
La diagnosi diretta è da preferire, consente lo studio
analitico di un determinato agente
eziologico, soprattutto per
quanto riguarda i determinanti genetici della virulenza e della
resistenza a farmaci chemioterapici.
La diagnosi diretta è universalmente praticabile,
La diagnosi indiretta trova indicazione nelle infezioni acute
e nella fase acuta (infezione primaria) delle infezioni
persistenti
Criteri per l’accettabilità e l’impiego routinario
di un test di diagnostica microbiologica
Specificità
Sensibilità
Praticità e rapidità di esecuzione
Costo contenuto
Materiali patologici
Essenziale per la diagnosi è che i campioni
che raggiungono il laboratorio siano ben
scelti e di buona qualità.
I campioni prelevati per la diagnosi
batteriologica possono provenire da zone
che sono solitamente sterili oppure da zone
che possiedono una popolazione microbica
residente (Tabella 1).
Zone normalmente sterili
Zone con popolazione batterica
residente
Differenti tipi di prelievo
Diversi tipi di campione
1) Proveniente da organi o tessuti prelevati
direttamente mediante ago aspirato
2) Prelevati in maniera indiretta per cui esiste
una possibilità più o meno indiretta di
contaminazione
3) Provenienti da zone con popolazione
batterica residente
• La qualità del campione è estremamente
importante per l’interpretazione dei risultati
Valutazione del risultato
• La presenza di un microrganismo deve essere presa in seria
considerazione solo se isolato da una zona sterile
• Solo se l’isolamento ed il trasporto sono stati eseguiti in
modo corretto
• Il campione proveniente da zone con popolazione residente
la valutazione sarà più difficile ed è necessario ricercare
patogeni che riguardano la patologia specifica come uno
Streptococcus emolitico in caso di faringite o un batterio
enteropatogeno in caso di gastroenterite
• Esistono poi campioni che non possono fornire nessuna
indicazione e quindi inutili ai fini diagnostici
Raccolta di campioni per la ricerca di batteri patogeni
Raccolta e trasporto
Informazioni
• Necessarie da inviare con il campione
1. Nome del paziente
2. Età e sesso
3. Provenienza anatomica del campione
4. Data ed ora del campione raccolto
5. Diagnosi clinica presuntiva
6. Eventuale trattamento antibiotico
TRASPORTO
NON DEVE CAUSARE ALTERAZIONI QUALITATIVE E
QUANTITATIVE DEL CAMPIONE
PER I CAMPIONI CLASSICI SONO DISPONIBILI SISTEMI STANDARDIZZATI
DI TRASPORTO, PER ALCUNI CAMPIONI PARTICOLARI SI DEVE PROCEDERE
AD IDENTIFICARE UNA PROCEDURA DI TRASPORTO SPECIFICA E
RIPETIBILE
Tempi di processazione
• I campioni urgenti devono essere processati
subito
• Gli altri campioni possono essere conservati
a 4-6 °C, per 2-3 ore senza avere danni
particolari.
• Ad eccezione di Nesseria gonorrhoeae e
Bordetella pertussis labili in ambiente
extracorporeo
Metodi di ricerca dei batteri
A: utile
per la
diagnosi,
B: utile
per la
diagnosi
di forme
specifich
e di
malattia,
C: test
non
utilizzat
o nei
laborator
i di
routine,
D: test
non utile
A: utile per la diagnosi, B: utile per la diagnosi di forme specifiche di malattia, C: test
non utilizzato nei laboratori di routine, D: test non utile
Metodi diagnostici
• Esame microscopico diretto
• solo alcuni elminti possono
essere visti ad occhio nudo ,
batteri, funghi e protozoi,
aggregati virali mediante
colorazioni. Più sensibile se si
utilizza un marcatore
fluorescente, anticorpo specifico
legante un colorante fluorescente
• Le particelle virali possono
essere osservate solo al
microscopio elettronico
Metodi diagnostici
• Coltura:
• è possibile la coltivazione in
terreni di coltura di molti batteri,
quelli intracellulari obbligati
come Clamidie, Rickettsiae e
virus devono crescere in colture
di cellule eucariotiche.
• Alcuni non possono essere
coltivati in vitro come
Treponema pallidum-
Metodi diagnostici
• Rilevazione di macromolecole:
• utilizzo di tecniche
immunologiche permette di
rilevare componenti proteiche o
polisaccaridiche dei
microrganismi. I prodotti
metabolici possono essere rilevati
mediante gas cromatografia
mentre le sonde genetiche
permettono l’individuazione di
sequenze di acidi nucleici nei vari
materiali
Metodi diagnostici
• Ricerca anticorpale
(diagnosi sierologica):
ricerca e quantizzazione di
anticorpi specifici prodotti
in risposta ad una infezione,
possono dare indicazioni di
una presenza o pregressa
infezione di uno specifico
agente infettivo
Diagnosi delle infezioni
batteriche
Esame microscopico diretto e coltura
Esame microscopico diretto in
campo oscuro
Treponema pallidum
Alcuni batteri particolarmente
sottili possono essere osservati al
microscopio ottico mediante
degli accorgimenti particolari
come il campo oscuro , in cui un
condensatore focalizza solo la
luce diagonale sul campione ,
mentre all’osservatore arriva la
luce riflessa dalle strutture
presenti nel preparato. I
microrganismi risultano
circondati da un alone luminoso
su sfondo scuro
Microscopia a contrasto di fase
Altra metodica per la visualizzazione di preparati in questo caso le
differenze di rifrazione nei campioni sono convertite in differenze
dell’intensità della luce nell’immagine , permettendo una migliore
visualizzazione nei campioni non colorati , viene usata per
osservare funghi o parassiti
COLORAZIONE DI GRAM
Safranina
Violetto di genziana
Soluzione Lugol
CONTRASTO
FISSARE
Decolorazione
Prelievo e dispersione del
campione
Fucsina
Colorazione di Gram
• Per una colorazione positiva è necessario:
1. L’integrità della parete
2. Non utilizzare colture batteriche troppo
vecchie batteri potrebbero essere morti
3. Batteri danneggiati dal trattamento con
l’antibiotico
Colorazione di Gram su
campione clinico
• I batteri saranno colorati di viola o di rosso
• Il materiale presente come leucociti PMN e
frammenti cellulari risulteranno colorati in
rosso
• Se viola il preparato non è stato decolorato
bene
• In presenza di pus è più facile individuare i
batteri
COLORAZIONE PER ALCOOLACIDO RESISTENTI
• BATTERI ALCOOLACIDO RESISTENTI
TRATTENGONO
FUCSINA FENICATA
(= FUCSINA BASICA
SCIOLTA IN ACQUA,
ALCOOL E FENOLO)
ANCHE DOPO
DECOLORAZIONE
CON ACIDO
CLORIDRICO
DILUITO IN ALCOOL
TERRENI DI COLTURA
•
GENERALI
– NUTRIENT AGAR, TRYPTIC SOY AGAR, MUELLER HINTON AGAR, BRAIN
HEART INFUSION AGAR ETC.
•
DIFFERENZIALI (SPESSO ANCHE SELETTIVI)
– AGAR SANGUE, McCONKEY AGAR, MANNITOL SALT AGAR, HEKTOEN
ENTERIC AGAR ETC.
•
SELETTIVI (SPESSO ANCHE DIFFERENZIALI)
– McCONKEY AGAR, MANNITOL SALT AGAR, HEKTOEN ENTERIC AGAR ETC,
SS AGAR, ENTEROCOCCOSEL AGAR.
Condizioni colturali
INCUBAZIONE
• AEROBIOSI
GENERALMENTE PRESENTI
TRE DIVERSI INCUBATORI
A 30°C, 37°C, 42°C
• ANAEROBIOSI
ATMOSFERA DI INCUBAZIONE
80% AZOTO
10% IDROGENO
10% ANIDRIDE CARBONICA
SALVO DIVERSE RICHIESTE SPECIFICHE
(CAPNOFILI, MICROAEROFILI, ED
ALCUNI ANAEROBI PARTICOLARI)
IDENTIFICAZIONE
• FENOTIPICA
• MORFOLOGICA
• BIOCHIMICA
Pseudomonas
aeruginosa
Clostridium
difficile
IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
•
•
ATTRAVERSO L’IMPIEGO DI SISTEMI AUTOMATICI O
SEMIAUTOMATICI, O CON L’ESECUZIONE DI SAGGI BIOCHIMICI
MANUALI IN CONDIZIONI STANDARD SI OTTIENE
L’IDENTIFICAZIONE SULLA BASE DI UN DATABASE STATISTICO DI
CARATTERISTICHE FENOTIPICHE PECULIARI DELLE SPECIE.
DIFFERENTI TIPI DI TEST VENGONO ESEGUITI PER DIFFERENTI
GRUPPI DI MICROORGANISMI
Batteri Gram negativi
Raccolta dei campioni e procedure diagnostiche per infezioni
fungine
Raccolta dei campioni e procedure diagnostiche per
infezioni fungine
Colorazione specifiche per individuare i funghi
Colorazioni
Gimsa Histoplasma capsulatum
Colorazione con argento cisti di
Pneumocisti jirovecii
Colorazioni
Bianco calcofluor lieviti e pseudoife di
Candida albicans
Colorazione di Gram ife
negative Aspergillus
SAGGI
ANTIBIOTICORESISTENZA
• ANTIBIOGRAMMA
– CONSENTE LA DETERMINAZIONE DI UN
PROFILO DI SUSCETTIBILITA’ ESPRESSO COME
SENSIBILE, INTERMEDIO, RESISTENTE
– OTTENUTO ANCHE CON SISTEMI AUTOMATICI
ATTRAVERSO SAGGI IN LIQUIDO SU POCHE
DILUIZIONI
• DETERMINAZIONE MIC ED MBC
– SI OTTENGONO I VALORI PRECISI DELLE
CONCENTRAZIONI DI CIASCUN ANTIBIOTICO
CHE INIBISCONO E/O UCCIDONO UN SINGOLO
CEPPO
SAGGI
ANTIBIOTICORESISTENZA
• ANTIBIOGRAMMA
• MIC
ANTIBIOGRAMMA
3-4 COLONIE
IN BRODO
37°C
0,5 McFarland
2-3 h
0,1 ml spatolati
37°C 18h
LETTURA ALONI DI
INIBIZIONE ED
INTERPRETAZIONE
DEI RISULTATI
DETERMINAZIONE MIC ED MBC IN LIQUIDO
3-4 COLONIE IN BRODO
37°C
0,5 McFarland
24 h
MIC
37°C 48 h
0,1 volumi
MBC
Diluizioni scalari antibiotico
37°C 48 h
Campioni per la diagnosi virale
Campioni per la diagnosi virale
Diagnosi delle infezioni virali
Esame diretto e coltura
Esame diretto e coltura
• L’esame al microscopio elettronico non è
mai utilizzato per la diagnostica virale per
la necessità di personale altamente
specializzato
• L’esame colturale dipende dal tipo di
materiale patologico che viene prelevato e
necessitano di linee cellulari generalmente
immortalizzate
Materiale patologico
• Il materiale patologico deve essere messo in soluzioni
tamponate ed inviato al laboratorio considerando che :
• Alcuni virus si inattivano dopo 1-2 ore
• Alcuni virus possono essere inattivati dal cotone del
tampone
• Il terreno di trasporto è una soluzione tamponata con 5%
di siero bovino fetale ed antibiotici per evitare
contaminazioni batteriche
• Per i campioni di urina il terreno deve contenere 35% di
sorbitolo
• Per i campioni provenienti da escrezioni del naso faringe
devono contenere triptosio
Isolamento virale
• L’isolamento si esegue su colture di cellule
possono essere:
• Cellule primarie provenienti da organi e tessuti
dopo trattamento con enzimi proteolitici hanno
vita breve
• Cellule di origine fibroblastica più longeve
• Cellule di tessuto neoplastico immortalizzate con
vita illimitata più facili da coltivare ma meno
sensibili all’infezione dei virus
Terreni per la coltivazione di
cellule
• Sono costituiti da soluzioni isotoniche bilanciate
di Sali contenenti:
• aminoacidi,
• acidi grassi,
• carboidrati
• vitamine
• Tamponate a pH 7,2 con bicarbonato
• Incubate a 32-37°C
Identificazione dei virus isolati
• L’effetto citopatico può essere sufficiente anche in
considerazione del tipo di cellule in cui replica
• Alcuni virus possono produrre agglutinine sulla
superficie della membrana delle cellule infette che
possono essere messe in evidenza mediante
adsorbimento
• Individuazione di antigeni virali mediante saggi
immunologici
Effetto citopatico
Effetto citopatico
• Caratterizzato da : arrotondamento delle
cellule con distruzione del citoscheletro
• Formazione di sincizi
• Arrotondamento ed aggregazione delle
cellule in grappoli
• Formazioni di inclusioni apprezzabili al
microscopio ottico dopo colorazione
Emoagglutinazione
Caratteri antigenici
Possono essere studiati mediante l’uso di anticorpi
monoclonali o policlonali mediante:
• Precipitazione
• Agglutinazione
• Marcatura enzimatica (enzyme immune assay
EIA), fluorescente (IFA), chemiluminescente
(CLIA), radioisotopica (RIA)
Rilevazione di macromolecole
microbiche
• La maggior parte delle metodiche usate
sono basate su reazioni immunologiche
definite anche come reazioni sierologiche a
rovescio. Si utilizzano anticorpi specifici
per legare antigeni microbici.
• Test di agglutinazione al lattice
• ELISA
• Immunofluorescenza
Reazioni di agglutinazione
E’ necessario un
antigene particolato
non troppo grande ma
neanche troppo
piccolo, l’antigene
può essere 1) sulla
superficie del
microrganismo , 2)
legato sulla superfiche
dell’eritrocita o su
particelle di lattice , 3)
coagglutinazione
quando l’anticorpo si
lega con FC alla
proteina A di
Stafiloccosus aureus e
con il FAB
all’antigene
Test di agglutinazione al lattice (AL)
• Gli antigeni polisaccaridici sono in grado di
legare particelle di lattice ricoperte di
anticorpi specifici
• Utilizzato per la ricerca per esempio del
materiale capsulare di alcuni microrganismi
come meningococco, pneumococco, ect
• Permettendo così una diagnosi precoce
ELISA (Enzyme lynked
immunoassorbent Assay)
• Nella forma più
semplice è la
capacità di un
anticorpo specifici
a cui sono legati
enzimi cromogeni
in grado di legare
un antigene.
Immunofluorescenza
• Esame diretto per la ricerca di
microrganismi eseguito con anticorpi
specifici marcati con fluoresceina.
• La fluorescina quando eccitata dalla luce di
una certa lunghezza d’onda emette una luce
maggiore di colore differente
Immunofluorescenza
Immunofluorescenza
• Metodica utilizzata per la ricerca diretta di:
• Bordetella pertussis negli strisci nasofaringei
• Legionella nei campioni di escreato o di lavaggio
bronco-alvelare
• Nesseria gonorrhoeae negli strisci uretrali
• Chlamydia trachomatis
• Possibile anche false reazioni positive in caso di
recettori Fc responsabili del legame con
l’anticorpo
Diagnosi sierologica di infezione
Misurano la risposta anticorpale
sierica del paziente in seguito ad
un’infezione
Test che saggiano una funzione biologica
degli anticorpi
• Test sierologici più vecchi misurano gli anticorpi
valutando la loro funzione in presenza dell’anticorpo.
• Per esempio l’aggiunta di siero di un paziente su
microrganismi inattivati può provocare un’agglutinazione
al lattice o una emoagglutinazione
• La reazione di fissazione del complemento rivela la
capacità del siero di attivare la cascata del complemento in
presenza dell’antigene o di inibire un’altra attività
biologica come per l‘inibizione dell’agglutinazione delle
emazie
Reazione di fissazione del complemento
Rivela la capacità di
un siero di attivare
la cascata del
complemento in
presenza di un
antigene
Test che evidenziano gli anticorpi in fase liquida
EIA-ELISA
SATURAZIONE
IN
ALCUNI
TEST
IMMOBILIZZAZ
LAVAGGIO
CON
POZZETTO
AGGIUNTA
AGGIUNTA
PER
RICERCA
DI
IONE
SOLUZIONE
CON
SOLUZIONE
SIERO
LAVAGGIO
CONIUGATO
ANTIGENI
DILUITO
ANTIGENE
DETERGENTE
CONCENTRATA
DILUITO
AGGIUNTA SUBSTRATO
IN
SATURANTE
NORMALMENTE
IN
SATURANTE
VIENEDI
IMMOBILIZZATO
TAMPONATA
PROTEINE
IN SOLUZIONE
E SVILUPPO DELLA
UN ANTICORPO
SPECIFICO
ALCALINA
PER
ALLONTANARE
NON
REATTIVE
REAZIONE
ANTIGENE
NON
(es. ALBUMINA)
LEGATO
Ricerca di anticorpi in fase solida
immunofluorescenza indiretta
SENSIBILITA’ DEI SAGGI
IMMUNODIAGNOSTICI
SAGGIO
SENSIBILITA’
(µg Ab/ml)
PRECIPITAZIONE
AGGLUTINAZIONE (diretta)
AGGLUTINAZIONE (passiva)
RIA*
EIA-ELISA *
IMMUNOFLUORESCENZA
24-160
0,4
0,08
0,0008-0,008
0,0008-0,008
8,0
*ELEVATA RIPRODUCIBILITA’ INTERTEST ED INTRATEST, POICHE’ ESEGUITI
DA SISTEMI AD ELEVATA AUTOMAZIONE
