Farmaci Biotecnologici
Mariapia Vairetti
Dipartimento di Medicina Interna e Terapia
Sezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare
Cosa sono?
1953: La
scoperta
del DNA
1973 - Università della
California:
nasce la tecnologia del
DNA ricombinante!
Tecnica del DNA ricombinante
Tecnica del DNA ricombinante:
inserire un segmento di DNA
all'interno di un organismo ospite,
permettendo la combinazione di
geni provenienti da specie molto
distanti tra loro:
Inserimento di un gene d’interesse
(es. gene umano che codifica per la
proteina
da
produrre
come
farmaco), in un organismo ospite,
fatto poi crescere in un fermentatore
industriale per produrre la proteina
Cos’è un“farmaco biotecnologico”?
Farmaco progettato
mediante la tecnologia
del DNA ricombinante.
Farmaco di sintesi
per cui sono usate
pratiche biotech nella
fase di progettazione
o di valutazione
Farmaci biotecnologici
• Il primo farmaco ottenuto
ingegnerizzando un sistema
vivente (batterico) è stato
l'insulina, approvato dalla FDA
nel 1982.
• Anche l'ormone della crescita
umano,
precedentemente
estratto dai cadaveri, fu
rapidamente ingegnerizzato.
• Nel 1986 la FDA approvò il
primo vaccino umano, contro
l'epatite B.
La struttura dell'Insulina
rosso:carbonio, verde:ossigeno;
blu:azoto; rosa:zolfo
La produzione industriale di farmaci utilizzando i sistemi viventi come
bioreattori si è da allora largamente diffusa, diventando attualmente la
via preferita di sintesi di numerosi farmaci, in particolare per il costo di
produzione relativamente basso.
I medicinali biotecnologici sono più
grandi e complessi di quelli chimici
Chimici
Biotecnologici
Aspirina:
Peso molecolare 180
Interferone beta: peso molecolare
19.000
Produzione
• Costi di produzione
Costo di uno stabilimento di produzione per
biofarmaceutici è maggiore di uno stabilimento
tradizionale (da 200 a 400 milioni $)
Pochi siti produttivi vs i molti dei prodotti tradizionali
• Metodi di produzione
Eventuale interferenza con la conformazione finale della
molecola.
• Diverso profilo di sicurezza: anche piccole variazioni nei
processi produttivi possono influenzare la sicurezza e
l’efficacia del farmaco
Farmaco-tossicologia
Biotech
Problemi negli studi di
assorbimento, distribuzione,
metabolismo, eliminazione
Specie animali con sensitività
simile agli umani
Reazioni Immunologiche negli
animali
Clinica – Prodotti classici
• Fase I - Studi iniziali effettuati su volontari sani per determinare il
metabolismo e le azioni farmacologiche del farmaco sull'uomo, la
sicurezza e gli effetti collaterali a diversi dosaggi. Questi studi
possono essere compiuti anche su pazienti per ottenere
informazioni molto preliminari sulla possibile efficacia della
terapia (Fase I-II). Il numero di soggetti studiati non supera gli 80.
• Fase II - Studi su pazienti per esplorare l'efficacia del farmaco
spesso attraverso il confronto fra un gruppo di pazienti che riceve
il trattamento ed un gruppo di controllo che riceve placebo. Anche
in questi studi si valutano la sicurezza e gli effetti collaterali. Il
numero di soggetti studiati non supera i 300.
• Fase III - Studi su pazienti per una valutazione definitiva del
rapporto rischi/benefici ai fini della registrazione del composto
come farmaco. Il numero di soggetti studiati non supera i 3000.
Clinica- Biotecnologici
Esperimenti sugli animali meno predittivi
Dose-risposta specifica: non lineare, a
campana,
Studi di dose escalation più approfonditi
Reazioni immunologiche
es: TNG 1412
Biotech: il mercato globale
63 Miliardi $ (2005)
Vendite raddoppiate dal 2000 al 2004
Al momento più di 190 farmaci biotecnologici sono
sul mercato (20% del totale) e sono stati assunti da
325 milioni di pazienti
Circa il 40% delle molecole in sperimentazione
clinica sono derivanti dalle biotecnologie
Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici
• Le tecniche di ingegneria genetica non sono prive di rischi e
pertanto devono essere utilizzate con cautela.
• Per evitare che dai risultati di queste manipolazioni si producano
effetti indesiderati o imprevisti, gli esperimenti sul DNA
ricombinante sono sottoposti a regole e a controlli molto severi.
• L’importanza assunta dai farmaci biotecnologici è comunque
ormai dimostrata dal fatto che a livello mondiale questi prodotti
rappresentano circa il 20% di tutti i nuovi farmaci convenzionali
approvati ogni anno.
Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici.
•Considerando che nel 2001 più di 200 proteine ricombinanti risultavano
in fase di sperimentazione clinica nell’uomo è prevedibile che nei
prossimi anni i nuovi farmaci biotecnologici continueranno a
rappresentare una percentuale significativa di tutti i nuovi farmaci che
saranno immessi nel mercato.
•Pertanto la portata di questa metodica è enorme.
•La possibilità di copiare con la massima precisione sostanze prodotte
fisiologicamente allarga enormemente la possibilità di intervento del
medico. Se da una parte l'impiego del Dna ricombinante consente di
creare nuovi farmaci, dall'altra può ottimizzare i farmaci già noti, ad
esempio rendendo più facile la loro assunzione.
Svantaggi delle biotecnologie
Sul Journal of Natural Products dove è stato pubblicato questo
studio si legge: "l'avvento di nuove tecniche di chimica
combinatoria negli anni '90 ha spinto molte industrie
farmaceutiche a cambiare metodo di ricerca". Quindi i chimici
hanno cercato la loro ispirazione per produrre nuovi farmaci nei
loro computer. Il risultato di ciò, spiega Newman, è che ci sono
sempre meno farmaci innovativi. Nel 2004 hanno concluso tutti
i test e sono giunti in commercio solo 25 nuovi farmaci.
David Newman, direttore del dipartimento Prodotti naturali del
National Cancer Institute americano. Dal 1981 ad oggi il 73%
di tutti i nuovi farmaci messi in commercio nascono
direttamente o indirettamente (tramite ottimizzazioni in
laboratorio) da vegetali, animali e invertebrati marini. E questo
nonostante i sempre maggiori investimenti in campi come le
biotecnologie.
Ricerche in Biotecnologia
La maggior parte delle ricerche sono volte alla
produzione di proteine o peptidi per scopi
terapeutici:
Ormoni polipetidici
Prodotti del sangue (coagulanti e trombolitici)
Farmaci antinfettivi e antitumorali
Immunomodulatori e vaccini
Prodotti Terapeutici
La maggior parte di farmaci proteici era disponibile
in quantità limitate
Prodotti ottenuti per estrazione dal sangue o tessuti
e organi dell’uomo o di animali con rischio di
trasmissione di malattie infettive
Insulina umana
il primo prodotto
“ricombinante” autorizzato
per uso terapeutico
INSULINA
L’insulina è prodotta dalle cellule
delle isole pancreatiche sotto forma
di un precursore di 110 aminoacidi
detto preproinsulina
La conversione della proinsulina in
insulina avviene nel complesso di
Golgi ad opera di endopeptidasi.
Effetti immediati e ritardati dell’insulina
1. Favorisce l’entrata di glucosio nelle
cellule
2. Nel fegato:
- favorisce la sintesi di glicogeno (utilizzo
del glucosio)
- inibisce la glicogenolisi (deg. glicogeno)
- inibisce la gluconeogenesi
3. Nei muscoli:
- promuove la sintesi proteica e inibisce il
catabolismo proteico
- promuove la sintesi di glicogeno
4. Nel tessuto adiposo:
- aumenta la sintesi di acidi grassi e
trigliceridi, riduce la lipolisi inattivando le
lipasi
Meccanismo d’azione dell’Insulina
In seguito al legame con l’insulina il recettore
viene subito internelizzato, in seguito ad
internelizzazione il recettore può essere
degradato o riciclato per tornare sulla
superficie della cellula.
Il legame dell’insulina al recettore porta ad
una rapida autofosforilazione dei residui di
tirosina, questo catalizza la fosforilazione di
altri substrati enzimatici.
L’insulina può anche controllare la sintesi di
secondi messaggeri, tramite l’attivazione della
fosfolipasi C che possono mediare l’azione di
enzimi cellulari.
Profilo fisiologico dell’insulina
Produzione: 0,6 U/kg/24h
- produzione basale continua, indipendente dai pasti
- secrezione episodica e rapida, in corrispondenza dei pasti
Glucosio plasmatico mmol/l
20
Soggetto
diabetico
15
10
Soggetto
normale
5
Pasti
0
0900
1200
1500
1800
2100
2400
0300
0600
Ore della giornata
Deficit di insulina: Diabete Mellito
Si tratta della principale patologia che interessa il pancreas
endocrino. Causa alterazioni del metabolismo ed iperglicemia
entrata di glucosio nelle cellule
di glucosio in circolo: gluconeogenesi epatica
glucosio
eccesso
extracellulare
deficit intracellulare
fame in mezzo
all’abbondanza
Diabete Mellito
DIABETE DI TIPO I
o INSULINO-DIPENDENTE
DIABETE DI TIPO II
o INSULINO-INDIPENDENTE
• Compare soprattutto nei
• Compare soprattutto negli
giovani
• Insulina virtualmente assente
• Causa chetosi
• Sembra avere cause
autoimmuni
• Si tratta con insulina esogena
adulti obesi
• Carenza recettori insulina
• Non causa chetosi
• Sembra avere cause
ereditarie
• Può essere tenuto sotto
controllo con una dieta
adeguata ed esercizio fisico
• Si tratta con antidiabetici orali
(sulfaniluree)
Analoghi dell’insulina
Sono prodotti in cui la sequenza aminoacidica propria dell’insulina
umana viene modificata ad arte con delle sostituzioni di uno o più
aminoacidi.
Insulina Lispro
Azione rapida (< 30 minuti)
Durata breve (3 ore)
1996
Analoghi dell’insulina
Concentrazione di insulina
libera nel sangue (µg/L)
Insulina Lispro
2.5
Insulina Umana Normale
Insulina Lispro
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
•
•
•
240
Tempo (minuti)
480
Somministrazione al momento del pasto (IR: 30 minuti prima)
Somministrazione dopo il pasto nei bambini molto piccoli
Minor accumulo sottocutaneo: minor rotazione delle sedi d’iniezione
Poiché l’azione termina dopo circa 4 ore è necessario associarla ad
un’insulina a lunga durata, per il mantenimento dei livelli basali
Analoghi dell’insulina
Insulina Aspart
Carica -
Azione rapida ( 60 minuti)
Durata breve (3 ore)
Analoghi dell’insulina
Insulina Aspart
Concentrazione di insulina
libera nel sangue (µg/L)
4.0
Insulina Umana Normale
Insulina Aspart
3.0
2.0
1.0
0.0
0
240
Tempo (minuti)
480
• Concentrazione plasmatica doppia in metà tempo rispetto a IR
• Necessario associare un’insulina ad azione ritardata per il controllo
della glicemia notturna
Analoghi dell’insulina
Insulina Glargina
Asp
Cariche +
Tempo di inizio ( 1.5 ore)
Lunga durata d’azione ( 24 ore)
Analoghi dell’insulina
Insulina Glargina
Utilizzazione del
Glucosio (mg/kg · min)
4
Insulina
Insulina Glargina
2
Termine dell’osservazione
0
0
•
•
•
10
20
24
Tempo (ore) dopo l’iniezione sottocute
30
Assenza del picco d’azione
Simula il profilo di secrezione continua di insulina dei soggetti non diabetici
Somministrazione 1 sola volta al giorno
Poiché formulata in soluzioni a pH acido non la si può somministrare
insieme ad altra insuline (pH neutro)
Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Ormoni Polipeptidici
Peptidi o piccole proteine che svolgono
funzioni essenziali nel controllo del
metabolismo nei mammiferi.
Alcuni sono farmaci salvavita
Ormone della crescita:
Humatrope®
Eritropoietina: regola la
produzione di globuli rossi da
parte del midollo osseo Epocim®
Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Proteine del sangue
Proteine o fattori coinvolti nei processi della coagulazione
del sangue (fattori VII, VIII, IX) sia nei processi che
degradano i coaguli (TPA)
Si sono eliminati i rischi associati alla potenziale
contaminazione da parte di agenti virali (HIV, HBV, HCV)
TPA: Activase®
Fattore VIII: Recombinate®
Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Immunomodulatori e Antitumorali
I più noti sono gli interferoni che
a seconda del tipo possono
esplicare attività antivirale ( e
), immunomodulatrice () o
antitumorale ().
Interferone : usato nel
trattamento di cancro al rene,
melanoma, alcune forme di
linfoma e leucemie.
IntronA®, Infergen®,
Alfaferone®, Roferon-A®
Interferone : usato per ridurre l’incidenza di
infezioni in pazienti con ridotte difese
immunitarie. Imukin®
Interferone : usato nel trattamento della SM,
agisce sui linfociti T inibendone la migrazione e
riduce la produzione di citochine. Avonex®,
Betaferon®, Rebif®
Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Immunomodulatori e Antitumorali
Altre molecole che trovano applicazione
nella terapia antitumorale sono le
interleuchine (IL-2), antagonisti del TNF
IL-2: usata nel trattamento di alcune forme
tumorali come il cancro al rene e alcuni
melanomi. Proleukin®
Antagonisti del TNF: usati nel
trattamento dell’artrite reumatoide
e psoriasica. Enbrel®, Remicade®,
I risultati dei farmaci biotecnologici:
anticorpi nella antitumorale
Circa il 30% delle pazienti con tumore mammario, produce
un'elevata quantità di una proteina, chiamata HER2, fondamentale per
la crescita del tumore. Contro l'HER2 è stato messo a punto un
farmaco, il trastuzumab, anticorpo monoclonale impiegato con
successo negli anni passati per trattare il tumore mammario
metastatico. Scarsi gli effetti collaterali con l'eccezione di un certo
grado di cardiotossicità in meno del 4-5% delle pazienti trattate.
L'anticorpo monoclonale è stato utilizzato associato alla
chemioterapia, nei tumori del seno in fase iniziale, subito dopo il
trattamento chirurgico. Il trastuzumab ha ridotto il rischio di ricaduta
del 50%. La sopravvivenza libera da malattia a 4 anni nelle pazienti
trattate con sola chemioterapia è stata del 67%, mentre in quelle
trattate con chemioterapia più trastuzumab è stata dell' 85%.
Vaccini
I vaccini “classici”:
- microrganismi uccisi (trattamento fisico
o chimico)
- microrganismi vivi attenuati
- tossoide
- coniugati secondo i principi di Jenner e
Pasteur
1995: sequenziato il genoma del primo
patogeno
(H. influenzae)
Vaccini Ricombinanti
Mediante la tecnica del DNA ricombinante sono stati
prodotti diversi vaccini la maggior parte dei quali è stata
allestita clonando in una cellula procariota o eucariota il
gene del microrganismo che codifica per la principale
proteina immunogena, cioè quella proteina che nell’ospite
porta alla produzione di anticorpi in grande quantità.
Vaccini a sub-unità
Vaccini virali: una proteina
Vaccini batterici: proteine di
del capside o della
membrana esterna
(envelope)
adesione (antigeni delle
fimbrie) o specifiche
tossine modificate
(anatossine)
Vaccino contro l’Epatite B:
1° Vaccino Ricombinante Autorizzato
• Epatite B rappresenta un grosso problema sanitario: il
virus responsabile (HBV), oltre che a causare la cirrosi
epatica è anche un agente cancerogeno (cancro al
fegato).
• Ad oggi il numero dei portatori cronici è stimati sui 300
milioni e possono trasmettere il virus a coloro che
vengano in contatto con sangue infetto, liquido
seminale, secrezioni vaginali, saliva, sudore o lacrime
perpetuando così il mantenimento dell’infezione.
Vaccino contro l’Epatite B:
1° Vaccino Ricombinante Autorizzato
• Virus a DNA con envelope
• Il virione contiene due antigeni associati al guscio
proteico interno (core): Hbc e Hbe e un antigene di
superficie (sull’envelope) HBsAg (Hepatitis B surface
Antigen)
HBsAg rappresenta quindi la
molecola di scelta per allestire il
vaccino.
Vaccino contro l’Epatite B:
1° Vaccino Ricombinante Autorizzato
• Il gene virale che codifica per HBsAg è stato
clonato in un vettore e quindi trasferito ed
espresso in un lievito S. Cerevisiae
• L’antigene prodotto dal lievito presenta tutte
le caratteristiche della proteina HBsAg
nativa (glicosilazione e altre modifiche posttraduzionali)
• Antigene viene purificato per
ultracentrifugazione, cromatografia e
precipitazioni frazionate (purezza > 98%)
viene adsorbito su Al(OH)3 che funziona da
adiuvante
Engerix-B®
Vaccino contro la Meningite Batterica
• Il maggior responsabile di questa patologia è il batterio
Haemophilus Influenzae di tipo b (Hib).
• Prima della diffusione del vaccino la Meningite Batterica colpiva
negli Stati Uniti 1 bambino su 200
• 1/4 dei bambini che sopravvivevano all’infezione presentavano
lesioni cerebrali o perdita dell’udito
Oggi, grazie al vaccino ricombinante la
meningite da Hib è una rarità: l’incidenza di
infezione si è ridotta del 90% ed in alcuni
paesi è addirittura scomparsa
Hiberix®
Produzione di tossine batteriche modificate,
da parte dello stesso ceppo patogeno, dopo
mutazione genetica
Vaccino Antipertosse
•
Mediante la tecnica del DNA ricombinante è
stato ottenuto un ceppo di Bordetella
Pertussis capace di produrre una tossina
della pertosse del tutto identica,
antigenicamente, a quella del ceppo
patogeno, ma assolutamente priva di
tossicità.
•
La tossina mutata, prodotta in laboratorio su
larga scala, viene purificata e impiegata
come vaccino
Vaccini vivi ricombinanti
Batteri o virus modificati
geneticamente in modo da poter
essere impiegati come vaccini
vivi ricombinanti
Vaccini vivi ricombinanti
Microrganismi eterologhi naturalmente non patogeni o resi tali
• Alcuni proxivirus e batteri del genere Salmonella ed
Escherichia
• Dopo ingegnerizzazione fungono da vettori di geni
esogeni, esprimono cioè le proteine immunogene
dell’agente patogeno verso cui si vuole proteggere
l’individuo
• Nuovi vaccini: si sono incorporati i geni di alcuni virus (Epatite B, H.
Simplex, Influenza Virus) nel genoma del Vaccinia Virus
• Nel coniglio, esperimenti preliminari di vaccinazione hanno dimostrato
che si ottiene protezione valida verso questi virus
• La scelta di questo virus “vettore” sta nella sua resistenza: un vaccino
così allestito non deve essere refrigerato e può venire liofilizzato e
somministrato mediante scarificazione cutanea
Vaccini vivi ricombinanti
Ceppi di microrganismi patogeni omologhi
• In questi microrganismi sono stati modificati o deleti i
geni che ne condizionano la virulenza
• Il microrganismo potrà moltiplicarsi nel soggetto
vaccinato, stimolando attivamente la risposta
immunitaria specifica senza però causare la malattia
• Virus Erpetico allo studio quale vaccino dopo
delezione del gene TK che causa la virulenza
• Batterio Vibrio Cholerae allo studio quale vaccino
dopo averlo privato della capacità di produrre
l’enterotossina attiva, ma ancora in grado di indurre
immunità
Dove è concentrata la ricerca
biotech nel mondo
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Onco
Infett
neuro
CVS
Source: PLG Italy – Convegno Novara 12-12-06 – Intervento G. Corsico - modificata
respi
Aids
Immuno
