Diapositiva 1

TRASPORTO
Trasporto del K+ nei batteri: gli ionofori mobili
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•
Trasportano gli ioni per diffusione attraverso la membrana
Tipicamente catalizzano il trasporto di 1000 ioni/s
La selettività e discriminazione fra ioni e’ altissima
Sono influenzati dalla fluidità della membrana
Eteri corona e criptandi
VALINOMICINA
È un antibiotico
naturale che
coordina
selettivamente lo
ione K+. Il
complesso
risultante passa la
membrana
cellulare del
batterio. Lo ione
K+ depolarizza la
membrana
uccidendo la
cellula.
La capacità di
trasportare il Na+
è 10000 volte
inferiore
Canali ionici per il trasporto del K+
Sul lato interno della membrana c’è un poro che porta ad una cavità centrale di circa 1 nm in
diametro. Gli ioni K+ idratati arrivano nella cavità attraverso il poro e qui si concentrano. Al di
sopra della cavità il tunnel si contrae a formare un filtro selettivo per dimensioni che
assomiglia ai pioli di una scala a chiocciola e che espone all’interno atomi di ossigeno di
gruppi carbonilici. Questi formano una sequenza di siti di coordinazione che consente agli ioni
K+ di attraversare il canale velocemente.
Lo ione K+ si sposta tra siti di coordinazione adiacenti. I legami di coordinazione sono deboli e
si formano e si rompono velocemente. In questo modo il K+ viene direzionato e non
intrappolato.
I siti del canale sono occupati
alternativamente da ioni K+ e da
molecole di acqua. Si passa da
coordinazione cubica a
coordinazione ottaedrica (4
ossigeni planari e due molecole di
acqua)
[K+] citoplasmatico >> [K+] extracellulare
Il K+ esce spinto dal suo GRADIENTE DI
CONCENTRAZIONE. L’interno della cellula resta carico
negativamente.
La negatività all'interno della membrana trattiene il K+(carica
positiva)
Si raggiunge un equilibrio tra le forze che spingono fuori il
K+(gradiente di concentrazione) e quelle che lo trattengono
all'interno (forze elettriche) quando il valore di potenziale di
membrana è di -90 mV.
Principali funzioni biologiche del Ferro
Fe è il metallo di transizione più abbondante negli esseri umani (da 4,2 a 6,1 g in un adulto).
Si trova, in una grande quantità di biomolecole. Le sue funzioni biologiche più conosciute
riguardano i processi di trasferimento elettronico e trasporto e attivazione di ossigeno
molecolare
Principali proteine di Fe in un uomo adulto:
Proteina
Funzione
e (eme); ne (non eme)
Mioglobina
Immagazzinamento di O2
(e)
Emoglobina
Trasporto di O2
(e)
Transferrina
Trasporto di Fe
(ne)
Ferritina
Immagazzinamento di Fe
(ne)
Citocromo c
Trasporto di elettroni
(e)
Citocromo ossidasi
Trasformazione O2  H2O
(e)
Citocromo P450
Attivazione e incorporazione di ossigeno
Proteine Fe-S
Trasporto di elettroni
(e)
(ne)
Ribonucleotide riduttasi Trasformazione RNA  DNA
(ne)
Catalasi
Metabolismo di H2O2
(e)
Perossidasi
Metabolismo di H2O2
(e)
In natura, il Fe(III) è presente in composti “quasi” insolubili
Strategia per assimilarlo
Il ferro libero dentro la cellula è tossico ed induce reazioni radicaliche
dannose
Strategia per stoccarlo
fino al suo utilizzo finale
Assimilazione del ferro
Fe(OH)3(s)
Fe3+(aq) + 3 OH-(aq)
Kps = 10-38 !!!!
La maggior parte dei microrganismi aerobi può captare quantità controllate di Fe.
Se si produce una deficienza di questo elemento essi ricorrono all’ambiente circostante
liberando degli ionofori chiamati siderofori, capaci di reagire con il Fe(III), complessarlo,
renderlo mobile e incorporarlo nella cellula.
Caratteristiche dei siderofori:
 ce ne sono più di 200
 PM inferiore a 1000 Da
 coordinano il Fe3+ formando complessi chelati molto stabili di geometria ottaedrica
 coordinano ione metallico hard con atomi di ossigeno
 costanti di formazione del complesso molto elevate (Kf = 1049)
 si suddividono in due classi
R
O
R
C
3+
+ Fe
N
-H+
idrossamati
R
OH
R
catecolati
O
R
C
O
-
C
Fe
R
N
O
-
Fe
R
N
O
-
Fe
O
Lieviti e funghi
O
Fe = Fe3+
-
batteri
Atomi leganti hard
Affinità per Fe(III)
hard più che per
Fe(II)
enterobactina
MECAM modello
sintetico
OH
OH
O
OH
OH
O
HN
NH OH
O
O
O
OH
NH
O
O
O
CH2
O
O
Riconoscimento
recettoriale
HN
O
CH2
NH
HN
OH
OH
OH
CH2
OH
O
OH
OH
I complessi Fe3+/ enterobactina, attraversano la membrana cellulare del
microrganismo per mezzo di recettori specifici e di proteine di
trasporto, e passano all’interno senza subire modifiche [V. Braun,
Science 282 (1998) 2202].
Data l’enorme stabilità del complesso (Kf= 1049), come è possibile nel
citoplasma il rilascio del ferro? Ci sono due meccanismi:
i) Riduzione enzimatica del Fe3+ a Fe2+. Lo ione ferroso è molto meno
hard e quindi la stabilità del complesso diminuisce in modo
significativo e dissociando consente il rilascio del ferro.
ii) Nel caso dei catecolati è probabile che i gruppi estere del ciclo del
legante subiscano idrolisi (da parte di esterasi), con apertura del
ciclo e distruzione del complesso
Tossicità del ferro libero
Il Fe viene incorporato come Fe(II), che è relativamente solubile in acqua a pH neutro. La sua
esistenza allo stato libero è pericolosa
Reazione
di Fenton
Fe2+ + H2O2
.
Fe3+ + OH- + OH
Nella membrana cellulare
OH. + RH
R. + O2
Autoossidazione
radicalica
ROO. + RH
.RH + .RH
H2O + R.
inizio
ROO.
ROOH + R.
HR-RH
propagazione
termine
Perciò gli organismi viventi hanno dovuto sviluppare meccanismi sofisticati per trasportare
ed immagazzinare il ferro
Transferrina
I mammiferi hanno sviluppato un sistema di trasporto e immagazzinamento complesso.
Nel metabolismo del ferro, non esiste un meccanismo escretorio specifico. Il metallo disponibile viene
riutilizzato più volte e in individui sani è necessario soltanto una ripristino limitato attraverso la dieta.
A questo fine il ferro ingerito è assorbito principalmente dalle cellule dell’intestino e passa nel sangue, dove
trova un trasportatore (la transferrina) che lo porta alle cellule del midollo osseo dove viene utilizzato per
sintetizzare emoglobina (forma nella quale si trovano i due terzi del contenuto del metallo nell’organismo).
Una parte del Fe passa nelle cellule del fegato e in
quelle di altri organi per formare altre
metalloproteine.
Quando
tutte
queste biomolecole
sono
catabolizzate (fegato, milza), il ferro viene
immagazzinato dalla ferritina. Da qui viene reso
mobile un’altra volta e preso dalla transferrina.
Transferrine
In generale, esse agiscono come agenti
antibatterici in questi fluidi perché, con il
sequestro del ferro presente negli stessi,
impediscono lo sviluppo dei
microrganismi, che hanno bisogno del
metallo per svilupparsi.
Servono, inoltre, per:
- solubilizzare il Fe(III) che, diversamente,
sarebbe insolubile a pH fisiologico;
- si legano saldamente al metallo,
riducendone la reattività (Kf = 1020)
- facilitano il rifornimento di ferro alle cellule.
Sono glicoproteine (PM 80kDa) costituite da
due lobi, ognuno contenente un sito per il
ferro.
sito attivo della lactoferrina
Una molecola di transferrina lega due
ioni Fe3+ e una quantità
stechiometricamente uguale di ione
CO32-
legami a
idrogeno
O
O
C
Asp
O
O
Fe3+ viene coordinato in geometria
ottaedrica grazie alla presenza dello
ione carbonato. Attorno al ferro c’è
ambiente hard di leganti.
C
O
Fe
O
O
N
Tyr
N
His
Tyr
Il legame dello ione carbonato (legante
bidentato) chiude la proteina che è
riconosciuta dai recettori di membrana
solo in questa forma (cioè quando
trasporta il ferro).
La coordinazione dello ione Fe3+
dipende dalla presenza dello ione
carbonato.
Meccanismo di trasporto cellulare di ferro mediato dalla transferrina
Il meccanismo di trasporto del Fe all’interno degli
eritrociti è un esempio di endocitosi mediata da un
recettore. La metalloproteina si unisce a un
recettore specifico della membrana (che non ha
affinità per l’apotranferrina). La parte interna della
stessa si ricopre con un reticolo formato da una
proteina chiamata clatrina, che aiuta a formare
prima una borsa e poi una vescicola (endosoma),
la cui membrana contiene pompe protoniche che
consumano ATP e sono capaci di modificare il pH
interno fino a portarlo a un valore fra 5,5 e 6. In
queste condizioni la metalloproteina, con la
protonazione dell’anione carbonato e dei leganti
tirosinato, perde il ferro, che si sposta fino al
citosol probabilmente attraverso un trasportatore
specifico.
Una volta lì esso può essere immagazzinato come ferritina o essere utilizzato. La apotransferrina,
ancora nella vescicola, si diffonde nuovamente verso il plasma dove viene liberata a opera del
recettore e può tornare a cominciare il ciclo.
Ferritina: meccanismo di immagazzinamento del ferro
La ferritina è (con la emosiderina) il sistema di
immagazzinamento del ferro.
La ferritina è una proteina solubile in acqua di 440 kDa (la
apoferritina). Ha 24 subunità equivalenti, disposte in geometria
sferica con diametro di ca. 12 nm con una cavità interna vuota di
ca. 7,5 nm di diametro. Questa si riempie di Fe(III) inorganico
formando un deposito.
La cavità può immagazzinare fino a 4500 ioni metallici,
anche se il contenuto tipico è 1200.
Se si tiene conto che ciascuna subunità ha circa 175 aa, la
capacità massima di immagazzinamento è approssimativamente
un Fe per residuo.
Nelle subunità si distinguono due tipi di canali:
1) Otto canali triangolari idrofilici (aspartati e glutammati)
2) Sei canali quadrati idrofobici (leucina)
Il Fe(II) entra attraverso i canali idrofilici. Una volta all’interno, esso è ossidato
dall’O2 che è entrato per i canali idrofobici a Fe(III) e immagazzinato in un
tipico processo di biomineralizzazione (come ossido e idrossido).
O2
Asp
Leu
Leu
Glu
Fe3+
Core inorganico
Fe2+
Ferritina: meccanismo di rilascio del ferro
Non tutto il ferro
immagazzinato
è Fe3+. Rimane
una piccola
quantità di Fe2+
importante per
la veloce
mobilizzazione
del minerale
Fe2+
Fe2+
Core inorganico
Molecola
piccola di
riducente
Agente chelante
Assimilazione del cis-platino
Cl
NH3
Pt
Cl
NH3
Il complesso è piano quadrato
Farmaco antitumorale indicato per tumori ai testicoli e alle ovaie
La sua scoperta è stata casuale
In commercio dal 1978
E’ somministrato per via endovenosa
Effetti collaterali: nausea, vomito
Nuovi analoghi: complessi di platino piano quadrati (cis) con due
leganti amminici e due alogenuri o carbossilati
Nel sangue [Cl-] = 0.1 M
Cl
NH3
Cl
+ H2O
Pt
Cl
Equilibrio di idrolisi è
spostato a sinistra
NH3
NH3
Pt
H2O
+
+ Cl-
NH3
Il complesso resta neutro e passa la membrana della cellula bersaglio per diffusione passiva
Equilibrio di idrolisi è
spostato a destra
Nel citoplasma [Cl-] = 0.003 M
Cl
NH3
+ H2O
Pt
Cl
Cl
NH3
NH3
Pt
H2O
+
+ Cl-
NH3
Il complesso diventa carico e non può più passare la membrana per uscire dalla cellula
bersaglio
La reazione di idrolisi può andare ulteriormente avanti
Cl
NH3
Pt
H2O
+
H2O
Cl-
H2O
NH3
Pt
NH3
H2O
2+
NH3 +
H2O
-
Pt
H+
NH3
HO
NH3
Le specie formate sono tutte cariche positive
NH3
Pt
O
Queste forme interagiscono con DNA che
è negativo
H2N
L
N
HN
N
N
R
guanine
NH3
Cl
NH3
+
Pt
H2O
- H2O
Veloce
NH
GG
3
Pt
Cl
NH
3
lenta
G
G
NH3
NH
Pt
3
NH
Meccanismi difensivi
ad opera di glutatione
Perché il trans platino non
ha attività antitumorale?
3
NH3
195Pt
NMR è la tecnica usata per
studiare gli addotti del platino con
il DNA
Cl
ASSIMILAZIONE E TOSSICITA’ DEL CROMO ESAVALENTE
 CrO42- passa la membrana attraverso un canale specifico per
anioni
 nel citoplasma viene ridotto dal glutatione
 il Cr(III) non può più uscire dalla cellula ed è capace di legare il
DNA
TRASPORTO E STOCCAGGIO DELL’O2
Mioglobina:
singola catena
polipeptidica
contenente un
gruppo eme
localizzato in una
tasca tra due
aeliche. È
localizzata nei
muscoli e serve ad
immagazzinare l’O2
Emoglobina:
tetramero
contenente 4 gruppi
eme. È localizzata
nei globuli rossi del
sangue e trasporta
l’O2 dai polmoni in
periferia.
Il gruppo eme
Composto di coordinazione
Tra Fe(II) e protoporfirina IX
La curva della
mioglobina è
iperbolica.
La curva della
emoglobina è
sigmoidale
Perché
emoglobina
modula la sua
affinità per l’O2
e la
mioglobina
no? Eppure
hanno il
medesimo
gruppo
prostetico…..
Fe(II) alto spin
pentacoordinato.
Istidina distale lega
l’eme alla proteina.
Raggio ionico
troppo grande per
allocare il Fe(II) nel
piano.
O2 coordina nella sesta posizione e Fe(II) passa a basso spin.
Raggio ionico diminuisce e il metallo entra nel piano della porfirina,
tirando con sé l’istidina prossimale e l’aelica.
EFFETTO COOPERATIVO
Perché il Fe(II) dell’eme deve essere ad alto spin con elettroni
spaiati per coordinare velocemente l’O2?
L’O2 ha elettroni spaiati?
Molecola di O2 secondo la teoria VB
O
2s
2p
O=O
Diamagnetica senza
elettroni spaiati
In realtà l’O2 è paramagnetico.
La teoria VB non è in grado di spiegare il paramagnetismo di O2, occorre
ricorrere alla
TEORIA DEGLI ORBITALI MOLECOLARI
 Gli orbitali molecolari sono funzioni matematiche che descrivono il
comportamento degli elettroni nella molecola
 il quadrato della funzione matematica esprime la probabilità di
trovare l’elettrone nella molecola
 gli orbitali molecolari sono una combinazione lineare degli orbitali
atomici che prendono parte alla formazione dei legami nella molecola
Consideriamo la molecola di H2:
Siano cA e cB le funzioni dei due orbitali atomici 1s dei due atomi di H, che
costituiscono il set di base
L’orbitale molecolare di H2 è:
= cAcA + cBcB
y= cA + cB
Dove i coefficienti cA e cB mostrano l’entità del contributo di quell’orbitale atomico
all’orbitale molecolare
MO di antilegame
MO di legame
Perché H2 esiste?
Perché He2 non esiste?
Per le molecole biatomiche mononucleari del secondo periodo, il set di base è costituito da
orbitali 1s e 2s e da tre orbitali 2p. La formazione degli MO richiede che siano rispettate le
seguenti regole:
 gli OA che si combinano devono avere energia confrontabile. Per esempio, 1s e 1s ma non
1s e 2s
 le superfici orbitaliche si devono sovrapporre il più possibile
 gli OA che si combinano devono avere la giusta simmetria
Gli MO si distinguono in s e p.
I s si formano dalle seguenti sovrapposizioni: - Due orbitali s, -Un orbitale
s e uno p con la giusta orientazione, Due orbitali p testa-testa
Gli MO p si formano dalla sovrapposizione laterale di OA p
Il diagramma di energia degli MO diventa il seguente:
I s hanno sovrapposizioni
maggiori quindi sono i più stabili
in energia nei confronti con i p
Diagramma degli orbitali molecolari della molecola di O2
s*
2 elettroni spaiati S= 1
p*
La molteplicità 2S+1 = 3
Ordine di legame =(6-2)/2= 2
2p
2p
p
Allo stato fondamentale
3O
s
s*
2s
2s
s
2
E
3O 2
ordine di legame
lunghezza
del legame
(pm)
E
2O2.-
1O22-
2
1,5
1
121
128
149
1O2
1O2
3O2
His prossimale
His prossimale
N
CH
N
N
C
Fe
CH
Piano anello
porfirinico
Alto spin, S = 2
CH
N
C
Fe
O2
CH
Piano anello
porfirinico
Basso spin, S = 0
Fe(II) alto spin è paramagnetico e può coordinare velocemente l’O2 che è paramagnetico (stato di
tripletto)
La forma ossigenata invece è diamagnetica. Questo risultato si può spiegare con due ipotesi
Forma ossigenata è diamagnetica: come si spiega?
Forma deossigenata è
paramagnetica
Fe(II) alto spin
S=2
Pauling
Weiss
Fe(II)
basso
spin +
1O
Fe(III)
basso
spin + O2-.
legato
2 legato
Fe
.+
Fe
O
O
Evidenze a supporto di entrambe le ipotesi
.O
O -