Diapositiva 1 - e

FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA DEI MICRORGANISMI
• Sostanze nutritive
• Ossigenazione
• Temperatura
• pH
LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI
I TERRENI DI COLTURA
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di “mezzi di
coltura” con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado
di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare.
I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche
necessarie per la crescita del microrganismo.
La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è naturalmente
differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera
coltivare.
In generale essi sono composti da:
• Carbonio;
• Idrogeno;
• Ossigeno;
• Azoto;
• Fosforo;
• Zolfo;
• Oligoelementi (ferro, calcio, cobalto, rame, manganese, ecc…)
FUNZIONE DEI PRINCIPALI ELEMENTI NEI
BATTERI
Element
% of dry
weight
Source
Function
Carbon
50
organic compounds or
CO2
Main constituent of cellular material
Oxygen
20
H2O, organic
compounds, CO2, and
O2
Constituent of cell material and cell
water; O2 is electron acceptor in
aerobic respiration
Nitrogen
14
NH3, NO3, organic
compounds, N2
Constituent of amino acids, nucleic
acids nucleotides, and coenzymes
Hydrogen
8
H2O, organic
compounds, H2
Main constituent of organic
compounds and cell water
Phosphorus
3
inorganic phosphates
(PO4)
Constituent of nucleic acids,
nucleotides, phospholipids
Sulfur
1
SO4, H2S, organic sulfur
compounds
Constituent of cysteine, methionine,
glutathione, several coenzymes
Potassium
1
Potassium salts
Main cellular inorganic cation and
cofactor for certain enzymes
Magnesium
0.5
Magnesium salts
Inorganic cellular cation, cofactor
for certain enzymatic reactions
Calcium
0.5
Calcium salts
Inorganic cellular cation, cofactor
for certain enzymes and a
component of endospores
Iron
0.2
Iron salts
Component of cytochromes and
certain nonheme iron-proteins and a
cofactor for some enzymatic
reactions
Tracce di Mn, Co, Cu, Zn, Mo
Principali “tipi nutrizionali” di Procarioti
Tipi nutrizionali
Fonte di
energia
Fonte di
carbonio
Esempi
Fotoautotrofi
Luce
CO2
Cianobatteri
Fotoeterotrofi
Luce
Composti
organici
Fitobatteri
Chemoautotrofi
o
Chemolitotrofi
Composti
inorganici
H2, NH3,
NO2 H2S
CO2
Archea
Chemoeterotrofi
o
Eterotrofi
Composti
organici
Composti
organici
La maggior
parte dei
batteri
Fattori di Crescita
Purine e Pirimidine
sintesi di acidi nucleici
Aminoacidi
sintesi delle proteine
Vitamine
coenzimi e gruppi funzionali di enzimi
Auxotrofi
TERRENI DI COLTURA
Terreno liquido e/o brodo nutritivo
È costituito da elementi nutritivi in genere un carboidrato (destrosio) o una fonte di
carbonio organico come digerito peptico di tessuto animale (peptone), digerito
pancreatico di caseina o gelatina, disciolti in acqua distillata alle concentrazioni
richieste.
Terreno solido
È costituito da componenti del brodo a cui si aggiunge agar (1.5-2%), polisaccaride
formato da più molecole di galattosio estratto da alcune alghe marine e non
utilizzato dai batteri come elemento nutritivo, utile solo per rendere solido il
terreno liquido. L’agar passa allo stato liquido alla T di circa 100°C, rimane liquido
fino a circa 45°C e solidifica a temperatura ambiente.
Terreno semisolido
È generalmente utilizzato per individuare la motilità microbica; è costituito da brodo
a cui si aggiunge agar in percentuale (0.3-0.5%) inferiore a quella che si utilizza per il
terreno solidificabile.
TERRENI
TERRENI
CON
FUNZIONE
DI
MANTENIMENTO
Permettono il mantenimento per un più
lungo periodo di tempo dei microrganismi
isolati.
TERRENI DI TRASPORTO
Sono semisolidi, non posseggono alcun
carattere nutrizionale, ma permettono la
vitalità del microrganismo.
TERRENI
TERRENI CHIMICAMENTE DEFINITI
Si conosce l’esatta composizione
TERRENI COMPLESSI
Non si conosce l’esatta composizione
(composti
biologici:
sangue,
latte,
lievito,estratti di carne etc)
TERRENI DI COLTURA
• Elettivi:
sono quelli sui quali, pur sviluppandosi molte
specie microbiche, la specie di elezione cresce in un tempo
più breve. Es. siero di Loeffler per i batteri della difterite.
• Selettivi: sono
quelli
che
contengono
sostanze
batteriostatiche che inibiscono o rallentano lo sviluppo di
molte specie microbiche.
Es. terreno di Lowestien Jensen per i batteri della
tubercolosi.
• Differenziali:
sono tutti quei terreni che contengono
sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che
avvengono nel terreno stesso.
Es. MSA per lo Staphylococcus aureus.
Lowenstein Jensen
Siero di Loeffler
Mannitol salt agar
TERRENI DI COLTURA
Agar sangue: terreno non selettivo per microrganismi più
esigenti, permette la coltivazione e il mantenimento di una
varietà di microrganismi che necessitano di fattori di
accrescimento e permette anche l’individuazione di attività
emolitica. Il sangue utilizzato proviene da animali (montone,
pecora) non trattati con agenti antimicrobici. Il sangue viene
aggiunto (5-10%) sterilmente al terreno base (Trypticase soy
agar o Columbia agar).
Enterococcosel agar: è un terreno selettivo usato per isolare gli
Streptococchi di gruppo D (Enterococchi); tale terreno contiene
oltre al terreno base (infuso di carne) agar, esculina e cloruro di
ferro: l’idrolisi dell’esculina indotta dagli Enterococchi
determina la precipitazione di ferro e l’annerimento del terreno.
TERRENI DI COLTURA
Mannitol Salt agar: terreno selettivo impiegato per l’identificazione
degli Stafilococchi, inibisce la moltiplicazione dei batteri Gramnegativi per la presenza di NaCl 7.5%, inoltre con tale terreno è
possibile mettere in evidenza Stafilococchi mannitolo fermentanti
(S. aureus, S.simulans, S. saprophyticus) per il viraggio di un
indicatore (il rosso fenolo che vira al giallo in seguito alla presenza
di radicali acidi liberati dalla fermentazione del mannitolo)
presente nel terreno.
MacConkey agar: terreno differenziale utilizzato per l’identificazione
degli enterobatteri e per differenziare
Escherichia coli e
Klebsiella, infatti quest’ ultimi fermentano il lattosio presente nel
terreno. Oltre il lattosio il terreno contiene un indicatore di
viraggio (rosso neutro), cristal-violetto (che inibisce la crescita dei
batteri Gram-positivi) e bile (che inibisce la crescita dei batteri
Gram-negativi diversi dagli enterobatteri).
MSA
MAC CONKEY
Sabouraud agar: terreno che permette lo sviluppo di lieviti e
muffe, e preparato ad un pH acido 5.6, è considerato un terreno
povero per mancanza di fattori di accrescimento, talvolta è
supplementato di glucosio e talvolta di antibiotici per ridurre
l’inquinamento batterico.
Agar cioccolato: costituito da terreno base a cui si aggiunge sangue
sterile, successivamente si riscalda sotto agitazione a 80°C fino a
che il terreno assume il colore del cioccolato dovuto alla cottura del
sangue. Viene utilizzato per lo sviluppo di microrganismi esigenti
(Neisseria, Brucella, Haemophylus, ecc.); se richiesto per lo sviluppo
del microrganismo, la piastra dopo la semina viene incubata in
presenza di CO2 (5-10%). Un esempio di agar cioccolato è il terreno
di Thayer Martin agar, a cui si aggiunge, dopo sterilizzazione, un
complesso di fattori di accrescimento e una miscela di antibiotici,
quali vancomicina, colistina, nistatina, inibenti rispettivamente germi
Gram-positivi, Gram-negativi e miceti. Tale terreno favorisce, in
condizioni ottimali adatte, lo sviluppo di Neisseria gonorrhoeae e N.
meningitidis
SABOURAUD
AGAR CIOCCOLATO
OSSIGENAZIONE
• Aerobi batteri che crescono in presenza di O2 libero;
• Anaerobi
batteri che crescono in assenza di O2
libero;
• Anaerobi facoltativi batteri che crescono sia
in
presenza che in assenza di O2 libero;
• Microaerofili
batteri che crescono in presenza di
piccole quantità di O2 libero.
Suddivisione dei batteri in base alle
temperature di crescita
BATTERI
T (°C)
T (°C)
T (°C)
MINIMA OTTIMALE MASSIMA
PSICROFILI
-10
10-20
30
MESOFILI
10
30-40
50
TERMOFILI
40
50-70
90
RIPRODUZIONE DEI
BATTERI
DIVISIONE CELLULARE
• Duplicazione del materiale genetico;
• Segregazione del materiale genetico
dopo la sua duplicazione;
• Settazione e cioè suddivisione della
cellula in 2 compartimenti distinti;
• Scissione della cellula nelle 2 cellule
figlie.
La riproduzione dei batteri è asessuata e avviene mediante
la divisione di una cellula in 2 cellule figlie uguali tra loro e
identiche alla progenitrice e viene definita scissione
binaria, processo molto simile, ma molto piu’ semplice della
mitosi cellulare.
Scissione binaria dell’Escherichia Coli; in rosso il nucleoide e in
verde il citoplasma
TEMPI DI GENERAZIONE DI ALCUNI BATTERI
IN CONDIZIONI OTTIMALI DI CRESCITA
BATTERIO
MINUTI
Vibrio natriegens
9.6
Bacillus stearothermophilus
10.8
Escherichia coli
21
Bacillus subtilis
26
Vibrio marinus
81
Mycobacterium tuberculosis
360
Se coltivati su piastre è possibile apprezzare la crescita
dei batteri che da invisibili si trasformano in colonie che
arrivano a 1 cm2 di superficie.
La crescita non risulta però essere costante nel tempo
infatti, se si analizza una colonia per un breve arco di
tempo si ottiene un curva di crescita, derivante dalla
relazione tra relazione tra il tempo (ascisse) e il
logaritmo del numero di batteri (ordinate).
FASI DI CRESCITA BATTERICA
1) Fase di latenza
Le cellule aumentano notevolmente di dimensioni, ma non nel numero. Nelle cellule vi è
un aumento di RNA e ribosomi. Il DNA rimane costante.
2) Fase di accelerazione
Breve periodo durante il quale le cellule iniziano a dividersi, ma non ancora a velocità
costante.
3) Fase esponenziale
Periodo di tempo durante il quale la divisione cellulare è mantenuta ad un ritmo
costante.
4) Fase di decelerazione
Periodo in cui si ha l’esaurimento delle fonti nutritive, variazioni di pH dovute alla
produzione di acidi.
5) Fase stazionaria
Il numero di cellule rimane costante per l’instaurarsi di un equilibrio tra le cellule che
muoiono e quelle che continuano a dividersi. Esaurimento di sostanze nutritive,
accumulo di prodotti tossici, diminuzione di O2 e sviluppo di un pH non idoneo.
6) Fase di declino o morte
La velocità con cui le cellule vanno incontro a morte dipende da specie a specie.
COLTURE CONTINUE
Lo scopo principale di questo tipo di colture è di
consentire che una popolazione batterica
mantenga, nella fase esponenziale, una velocità
di crescita costante per un periodo di tempo
indefinito.
Apparecchiatura impiegata: Chemostato
CHEMOSTATO
.
ESAME COLTURALE
L’identificazione
delle
colonie
viene
eseguita
ricorrendo a colture pure derivate da ciascun tipo di
colonia precedentemente isolata e si basa sullo studio
di alcuni caratteri:
ASPETTO DELLE COLONIE
CARATTERI MICROSCOPICI (MORFOLOGIA E
CAR. TINTORIALI)
CARATTERI BIOCHIMICI
Fermentazione degli zuccheri
Produzione di prodotti metabolici peculiari
Presenza/assenza di enzimi particolari
CARATTERI AG
ESAME COLTURALE
Consiste
Nell’isolamento dei batteri presenti in un materiale
impiegando in terreni più adatti allo sviluppo della specie
di cui si desidera accertare la presenza
Si usano dei terreni solidi e il materiale viene seminato
per strisciamento sulla superficie dell’area di semina, ciò
consente di ottenere delle colonie sufficientemente
distanziate per procedere poi alla loro identificazione
Dalle colture isolanti, soprattutto se eseguite su terreni
selettivi ed indicatori si ottengono alcune informazioni
che possono orientare e sul numero di specie batteriche
presenti e sulla loro identificazione
Molto utili sono le caratteristiche cromatiche e l’aspetto
delle colonie
Staphylococcus aureus
Mannitol Salt Agar
Streptococco fecalis
enteroccosel agar
Rhodotorula rubra
Sabouraud agar