i virus fitopatogeni e lRNA silencing - e

I virus
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Un virus e’ una nucleoproteina che si moltiplica e che ha l’abilita’ di causare malattie
•
Il numero totale di virus conosciuto a tutt’oggi raggiunge le 2000 “specie”
•
Un virus puo’ infettare una o dozzine di differenti specie di piante e ogni pianta puo’ essere
attaccata da differenti virus
•
Benche’ i virus possano assumere diverse forme sono sostanzialmente a forma bastoncellare,
poliedrica o varianti di queste forme
•
I virus non si dividono e non producono nessun tipo di strutture specializzate di riproduzione
(spore..)
•
I virus causano una malattia attraverso la semplice occupazione degli spazi, l’uso di sostanze
cellulari durante la riproduzione e alterando I processi cellulari
•
I virus vegetali sono molto diversi da tutti gli altri patogeni delle piante non solo in taglia e forma
ma anche nella semplicita’ della loro costituzione chimica, della struttura, dei metodi di infezione,
moltiplicazione, traslocazione all’interno dell’ospite, disseminazione e sintomi prodotti
•
E’ molto difficile diagnosticare la presenza di virus, molto spesso si formano però delle vere e
proprie inclusioni cellulari che consistono di particelle virali visibili al microscopio ottico
Detection dei virus vegetali
• I metodi per rilevare i
virus vegetali coinvolgono
principalmente la
trasmissione dei virus da
una pianta malata a una
sana per innesto o
grattando le foglie di
piante sane con il fluido
cellulare di piante malate
• Il metodo migliore per
rilevare un virus e’ dato
dalla purificazione, la
microscopia elettronica e
la sierologia
• Inoltre negli ultimi 5-10
anni e’ aumentato l’uso di
sonde a RNA o DNA per
amplificare il genoma virale
Morfologia dei virus vegetali
• I virus vegetali possono essere di
diverse forme e taglie
• Piu’ della metà sono allungati
(bastoncellari, A-B; A2) e
altrettanti sono sferici
(isometrici o poliedrici, D) con I
rimanenti che sono cilindrici e
bacilliformi (C)
• Alcuni virus sono bastoncelli rigidi
di circa 15-300 nm
• In sezione trasversale i virus
bastoncellari appaiono come tubi
vuoti in cui le proteine formano le
pareti e gli acidi nucleici sono
intercalati sempre spiralmente
tra 2 subunita’ proteiche
Composizione e struttura
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Ogni virus consiste al minimo di un acido nucleico e un tipo di proteina
Alcuni virus consistono di più tipi di acidi nucleici e di proteine e altri hanno
enzimi o lipidi
Gli acidi nucleici costituiscono dal 5 al 40 % del virus mentre le proteine fanno
il resto
Il genoma virale e’ abbastanza piccolo (1-3x106 Da) se comparato a quello dei
batteri (1.5x109 Da)
La parte proteica e’ composta di subunità ripetute, la cui composizione
aminoacidica varia da virus a virus e anche all’interno dello stesso tipo virale
La subunita’ proteica di TMV consiste di 158 AA in una sequenza costante
con una massa di 17.6 KDa
Ogni particella di TMV consiste di circa 130 giri d’elica di subunita’ proteiche,
tra cui e’ “impacchettato” il genoma
La maggior parte dei virus vegetali e’ a RNA ma ci sono esempi anche di virus a
DNA (su 1000; 800 a ssRNA, dsRNA, 110 ssDNA e 80 dsDNA)
Esistono poi dei virus (satellite) che non sono in grado di replicarsi da soli
nell’ospite ma hanno bisogno di un virus helper, di cui pero’ spesso ne causano il
rallentamento della replicazione
Sono stati trovati anche degli RNA satellite all’interno di virioni di virus
multicomponenti
Genoma virale
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Il capside proteico virale non e’ solo un contenitore di acidi nucleici
ma gioca un ruolo importante nel determinare la trasmissibilita’
virale, infatti la sua presenza aumenta l’infettivita’ del virus
Alcuni virus hanno nel loro genoma una trascrittasi che serve per la
loro moltiplicazione e infezione
La capacita’ del RNA virale di riprodursi indica che nell’RNA stesso
ci sono tutti i determinanti genetici del virus
In alcuni virus la quantita’ di acidi nucleici a disposizione e’
aumentata dal fatto che la sequenza codificante di alcuni geni e’
sovrapposta con quella di altri
Il numero di basi usati per la sintesi delle subunita’ proteiche del
capside e’ solo una piccola parte del genoma virale (158 bp contro
2130 in TMV)
La parte rimanente di genoma serve per codificare RNA polimerasi,
altre proteine strutturali, di movimento, di interazione con il
vettore, nucleasi e altre per produrre i corpi di inclusione
Infezione e biosintesi virale
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La sintesi delle proteine
virali avviene grazie al
ruolo di mRNA svolto
dall’RNA virale
Il virus utilizza gli AA, i
ribosomi e il tRNA
dell’ospite
L’RNA replicato e le
proteine prodotte sono
ad uso esclusivo del virus
Non appena si producono
le proteine del capside
queste si associano con
l’acido nucleico e si
forma un virus completo
I primi virioni intatti
compaiono nelle cellule
10 ore dopo l’infezione
Sintomi locali
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Tutti le malattie virali sembrano
causare nanismo o appassimento della
pianta intera e la riduzione della
produttivita’
In molte piante inoculate
artificialmente con alcuni virus si ha la
comparsa di piccole lesioni clorotiche o
necrotiche soltanto nei punti di inoculo
(lesioni locali)
Molti virus infettano i loro ospiti senza
causare lo sviluppo di alcun sintomo
visibile
Tali virus sono chiamati latenti e gli
ospiti come portatori asintomatici
In altri casi piante che sviluppano i
sintomi dell’infezione possono, se
infettate da certi tipi d virus, essere
temporaneamente senza sintomi in
certe condizioni ambientali (alte o
basse T) (sintomi mascherati)
Traslocazione dei virus
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Quando un virus infetta una pianta si
muove da una cellula all’altra e si
moltiplica in tutte le cellule
I virus si muovono attraverso i
plasmodesmi moltiplicandosi nelle
cellule parenchimatiche
Nelle cellule fogliari i virus si muovono
di circa 1 mm (8-10 cellule) al giorno
Molti virus comunque richiedono 2-5
giorni per uscire da una foglia infetta
I virus raggiungono il floema e da qui
vengono rapidamente trasportati verso
i meristemi apicali
Nel floema i virus infettano la pianta a
livello sistemico rientrando nelle cellule
parenchimatiche adiacenti ai tubi
cribrosi
I virus a mosaico infettano tutti i
tessuti della pianta e ogni cellula
vegetale infettata puo’ contenere
anche 10 milioni di particelle virali
Le proteine di movimento
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I virus si propagano attraverso i plasmodesmi che sono una sorta di canalicoli di circa
50 nm di diametro. Le loro pareti sono “tappezzate” dalla membrana plasmatica,
mentre la cavita’ centrale è occupata da una duplice membrana di RE cui e’ addossata
una serie di proteine.
Il lume del plasmodesma e’ ridotto a 4-5 canalicoli di 2-3 nm di diametro, che
consentono il passaggio di molecole di raggio non superiore a 1 nm e peso molecolare
di 1 KDa e quindi hanno un limite di esclusione ben superiore al diametro delle
particellle virali (3-90 nm) o dei loro acidi nucleici liberi (3-5 nm)
Esistono pero’ plasmodesmi con limiti di esclusione diversi. Ad esempio nei tricomi il
diametro e’ di 4nm (7KDa) e altri che collegano le cellule compagne con i tubi cricrosi
di 6nm (25KDa)
Per avere ragione di tali barriere dimensionali, insuperabili nel caso delle cellule
parenchimatiche, I fitovirus hanno sviluppato strategie di trasporto i cui agenti sono
le cosiddette proteine di trasporto o di movimento
Queste proteine non strutturali (non sono parte integrante delle particelle virali)
sono codificate dal genoma del 75% dei taxa virali noti e regolano il passaggio
intercellulare delle unita’ infettive interagendo con i plasmodesmi
Nelle piante esistono proteine endogene non virali che regolano il traffico
macromolecolare intercellulare agendo proprio sui plasmodesmi
E’ possibile che queste proteine costituiscano i fattori dell’ospite di cui e’ stata
ipotizzata la collaborazione con le proteine virali di movimento
Le proteine di movimento
• Le proteine di trasporto note sono
rapportabili a 4 principali
raggruppamenti
– Proteine della superfamiglia 30K
– Proteine del triplo blocco
– Proteine ricche in prolina
– Altri tipi di proteine
La superfamiglia 30K
•
•
E’ costituita da proteine di dimensioni variabili tra 22 e 50 Kd e contengono
un motivo conservato di 30 AA
Sono state identificate nei seguenti taxa
–
–
–
–
•
ssRNA (+) virus: tobamovirus, tobravirusAlfamovirus, Comovirus e molti altri
ssRNA (-) virus: tospovirus
dsDNA virus: Caulimovirus, Badnavirus
ssDNA virus: geninivirus
La proteina meglio studiata e’ la 30K di TMV che svolge le seguenti funzioni:
– Aumenta la permeabilita’ dei plasmodesmi portando il limite di esclusione da 1,5
fino a 9 nm
– Favorisce il dispiegamento dell’RNA virale linearizzandone la molecola
– Si lega all’RNA virale formando complessi di 3-5 nm di diametro
– Accompagna l’RNA virale attraversando i plasmodesmi come parte del complesso
di trasporto
– Protegge l’RNA virale dall’attivita’ nucleolitica delle cellule dell’ospite
– Indica la direzione del trasporto attraverso segnali di localizzazione
plasmodesmica
•
Le proteine 30K-simili sono state individuate nel canale dei plasmodesmi,
nella parete cellulare in prossimita’ dei plasmodesmi delle cellule infette, in
associazione col reticolo endoplasmatico e col citoscheletro
Sintomi sistemici
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Le piante possono mostrare
sintomi acuti e severi subito dopo
l’infezione che possono portare a
morte di rami giovani o dell’intera
pianta
Se l’ospite sopravvive all’infezione
puo’ mostrare sintomi cronici che
possono essere recuperati
In altri casi questo stato cronico
porta a deperimento la pianta
intera
I tipi di sintomi piu’ comunemente
registrati nelle infezioni virali sono
I mosaici o le macchie anulari
(mosaics and ring spots)
I mosaici sono caratterizzati da
aree verde-pallido, gialle o bianche
intervallate con aree normali su
foglie, fiori e frutti
I ring spots sono caratterizzati
dalla comparsa di anelli clorotici o
necrotici sulle foglie e qualche
volta su fusto e frutti
Fisiologia delle piante infettate da virus
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I virus vegetali non contengono nessun enzima, tossine o altre sostanze
patogeniche ma ciononostante riescono a indurre molti sintomi diversi
nell’ospite
La semplice presenza del virus stesso, anche in grandi quantita’, non basta a
spiegarli
Le malattie virali non sono dovute principalmente ad una deplezione dei
nutrienti che sono stati deviati verso la sintesi del virus stesso, ma piuttosto
a effetti indiretti che il virus ha sul metabolismo dell’ospite
Questi efetti sono indotti probabilmente dalla sintesi, indotta da virus, di
nuove proteine alcune delle quali sono biologicamente attive (enzimi) e
possono interferire con il normale metabolismo dell’ospite
I virus generalmente causano un decremento del tasso fotosintetico
attraverso un’alterazione della quantita’ di clorofilla, dell’efficienza della
clorofilla stessa e dell’area fogliare
I virus usualmente causano un decremento delle sostanze ormonali attraverso
l’induzione della produzione di sostanze inibenti la crescita
Un decremento nell’azoto solubile durante la sintesi rapida di virus e’
abbastanza comune e in particolare nei virus a mosaico c’e una cronica
deplezione dei livelli di carboidrati nei tessuti vegetali
RNA silencing
• RNA silencing is an evolutionarily conserved sequencespecific gene-inactivation system that also functions as an
antiviral mechanism in higher plants and insects.
• To overcome antiviral RNA silencing, viruses express
silencing-suppressor proteins which can counteract the
host silencing-based antiviral process.
• After the discovery of virus-encoded silencing suppressors,
it was shown that these viral proteins can target one or
more key points in the silencing machinery.
• RNA silencing and expression of viral silencing suppressor
proteins are tools forged as a consequence of virus–host
coevolution for fine-tuning host–pathogen coexistence.
RNAi
• RNA silencing relies on small RNA (sRNA) molecules,
approximately 21–24 nucleotides long, so-called short
interfering RNAs (siRNAs) and micro RNAs (miRNAs)
• RNA silencing is triggered by double-stranded (ds) or
self-complementary foldback RNAs that are processed
into 21–24 nt short siRNA or miRNA duplexes by the
RNase III-type DICER enzymes
• These miRNAs and siRNAs activate a multiprotein
effector complex, the RNA-induced silencing complex
(RISC) of which Argonaute protein (AGO) is the slicer
component showing similarity to RNase H
RNA interference
• RISC is the executioner of RNA silencing, inhibiting
target RNA expression.
• The specific recognition of target sequences is guided
by the siRNAs through a base-pairing mechanism,
whereas the slicing of target RNA is carried out by the
AGO proteins at the post-transcriptional or
transcriptional levels
• Short RNAs can also guide another effector complex,
namely the RNA-induced transcriptional gene silencing
(RITS) complex to direct the chromatin modification of
homologous DNA sequences
• RNA interference
(http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai
/animation/index.html)
RNA-BASED ANTIVIRAL IMMUNITY
• One of the best-established functions of RNA
silencing is antiviral defense, which was first
discovered in plants
• The antiviral functions of RNA silencing are
supported by the following observations:
– first, virus-derived siRNAs (viRNAs) accumulate at
high level during viral infections and can effectively
target the viral RNA.
– Second, most, if not all, plant viruses have evolved
virulence factors called viral suppressors of RNA
silencing (VSRs) to overcome the RNA silencing-based
host defense.
Current model of antiviral RNA
silencing and its suppression in plants.
•
•
•
•
RNA silencing is initiated by the
perception of viral dsRNA or partially
double stranded hairpin RNA, which are
processed to 21 nt viral siRNAs (viRNAs)
by siRNA specific RNAses called Dicer like
4 (DCL4) in association with dsRNAbinding protein 4 (DRB4).
The viRNA are stabilized by 2u-Omethylation by HUA ENHANCER1 (HEN1)
and afterward incorporated into
Argonaute1 (AGO1) protein, the major
antiviral slicer.
The viral RNA molecules cleaved by RISC
and viral RNAs lacking 5’- or/and 3’- end
are likely recognized being aberrant RNAs
(abRNA) and converted to dsRNA by RDR6
action.
This dsRNA processed again viRNAs, that
leads to generation of more viRNA and
amplification of the silencing response
SILENCING SUPPRESSION STRATEGIES
• More than 50 individual VSRs (virus silencing repressors-Viral
SuppresoRs) have been identified from almost all plant virus
genera, underlining the need of their expression for successful
virus infection.
• Available data suggest that virtually all plant viruses encode at
least one suppressor, but in many cases viruses encode more
than one
• Due to their evolution many of the suppressors identified to
date are multifunctional: beside being RNA-silencing
suppressors they also perform essential roles by functioning as
coat protein, replicase, movement protein, helper component
for virus transmission, protease or transcriptional regulators.
• Virtually all steps of the silencing pathway have been found to
be targeted by VSRs; either acting on silencing-related RNA
molecules or through protein–protein interaction
Suppressors targeting silencingrelated RNAs
• The most widely used
suppression strategy, adopted
by many viral genera occurs
through siRNA sequestration
which prevents assembly of
the RISC effector complex
• p19 homodimer acts like a
molecular caliper, which
measures the length of siRNAs
and binds them with high
affinity in a sequenceindependent way selecting for
the 19 bp-long dsRNA (duplex
region) of the typical siRNA
Suppressors targeting silencingrelated RNAs
• p14 and p38 are potent
VSRs and bind long and
short dsRNAs (including ds
siRNAs) in a sizeindependent way
• p14 and p38 may interact
with the viral dsRNA,
inhibiting the RNA-silencing
machinery on two levels:
– (i) by siRNA sequestration
– (ii) by interfering with DCL4mediated vsiRNA processing.
Suppressors interacting with
silencing-related host proteins
• The 2b protein of CMV was
one of the first VSRs
described.
• 2b prevents the spread of
the long-range silencing
signal, and so facilitate the
systemic virus infection
• 2b has been found to
physically interact on PAZ
and part of the PIWI
domain with siRNA-loaded
AGO1, and inhibits its
slicing activity
Other silencing suppressor
strategies
• The p69 protein suppresses
RNA silencing induced by
sense–transgenes (SPTGS) but
not silencing induced by
inverted-repeat transgenes
(IRPTGS)
• these suppressors could
interfere with dsRNA
generation by inhibition of
plant RDRs or other
components of this pathway.
• Consistent with these
observations is the fact that
p69 expression leads to a
phenotype characteristic for
rdr6 mutant
SILENCING SUPPRESSORS AND
VIRAL SYMPTOMS
• Although many VSRs have been identified as pathogenic
determinants largely responsible for virus-induced symptoms, the
molecular basis for virus-induced diseases in plants has been a longstanding mystery
• It is well established that the antiviral and endogenous silencing
pathways share common elements, and VSRs have been shown to
interfere with those pathways. siRNA-binding VSRs (e.g. HC-Pro and
p19) could interact with siRNA and miRNA biogenesis at different
stages.
• This interference may alter endogenous gene expression regulated
through miRNAs or siRNAs.
• Similarly, long dsRNA-binding VSRs (e.g. p38 and p14) could
compromise DCLs or AGO1-targeting VSRs (e.g. P0 and P1) inhibit
RISC activities, which in turn may alter the expression of an
unpredictable number of genes involved in plant development.
• Indeed expression of VSRs in transgenic plants leads to phenotypes
that mimic virus symptoms
Il silenziamento genico – strategia
OGM
• Gli acidi nucleici transgenici possono essere progettati in
modo da agire come molecole trappola che competono con il
genoma virale infettante
• Questo tipo di inibizione competitiva – silenziamento genico
post trascrizionale (PTGS) – è stato già dimostrato in casi in cui
il transgene codifica per una molecola di RNA o di DNA
difettiva (e perciò interferente)
PTGS - 1
•
•
•
•
La produzione di RNA aberranti
(aRNA) funziona da segnale di
attivazione del meccanismo di
silenziamento
In seguito all’ingresso dei virus nella
cellula vengono liberate copie di
ssDNA virale (1) può avvenire
l’appaiamento diretto tra DNA virale
e transgene trappola (2),
determinando la formazione di
ssRNA aberranti (3).
In alternativa trascritti derivanti dal
transgene antisenso/senso
ibridizzano con mRNA virale
(senso/antisenso) determinando la
formazione di dsRNA aberrante
Se questi si accumulano al di sopra di
un valore soglia (4) si attiva il
silenziamento genico
1
35S
transg
Appaiamento diretto
2
trascrizione
3
ssDNA
ssRNA ab.
RNA virale
4
.
Accumulo di dsRNA aberrante
PTGS - 2
• Le molecole di aRNA
possono attivare le metilasi
(5) che abbassano
l’espressione del transgene
(6) oppure possono attivare
RNA polimerasi RNAdipendenti codificati
dall’ospite (RDRP) (7) che
producono copie di RNA che
sono complementari ai
trascritti virali (cRNA)
CH3
1
35S
6
transg
Attivazione
di metilasi
trascrizione
5
Ss o dsRNA ab.
RNA ab.
Attivazione
di RDRP dell’ospite
7
.
.
.
Accumulo di cRNA
PTGS- 3
•
•
•
Gli RDRP utilizzano molecole di aRNA
come stampi per produrre copie di
RNA (8) che sono complementari ai
trascritti e si legano a questi e a quelli
del transgene determinando
l’accumulo di RNA che ibridizzano con
le sequenze silenziate
Questo abbassa la produzione dei
prodotti genici virali anche quando la
velocità di trascrizione è alta (9)
I cRNA o i dsRNA possono anche
muoversi sistemicamente in tutta la
pianta inducendo il meccanismo di
silenziamento in tutte le cellule
dell’ospite
Complesso RDRP
RNA ab.
RDRP
8
cRNA
.
.
.
9
Degr. RNA
10
Diffusione sistemica di cRNA
Current model