Preparazione dei campioni

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Dipartimento di Scienze Biomediche
- Sezione Embriologia Medica -
Università di Catania
Corso di Istologia ed Embriologia – polo B -
Testi Consigliati:
• Istologia di V. Monesi Ed. Piccin
• Larsen - Embriologia Umana - Ed. Gnocchi
o
• Barbieri - Carinci – Embriologia – Casa Editrice Ambrosiana
Dr. Imbesi Rosa
1
Materia Vivente= Tutto ciò che ha la capacità di
riprodursi o di replicarsi
• UNITA’ DI MISURA DI LUNGHEZZA:
- micrometro (mm) = 10-3 mm
- nanometro (nm) = 10 -3 mm
- Angstrom (Å) = 10 -1 nm
• UNITA’ DI PESO:
- milligrammo (mg) = 10-3 g
- microgrammo (mg) = 10-6 g
- nanogrammo (ng) = 10-9 g
- picogrammo (pg) = 10-12 g
• Dalton = unità di massa molecolare
2
Corrisponde al peso dell’atomo di idrogeno considerato come unità
LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLA
SOSTANZA VIVENTE
Virus, viroidi e prioni
Cellula
vegetale
Procarioti
Batteri
Cellula
animale
Alghe
batterio
unicellulari
Eucarioti
pluricellulari
Protozoi
Protofiti
virus
ribosoma
Proteina
globulare
aminoacidi
3
atomo
CELLULA
La più piccola unità vivente
Cellula
Cellula
Cellule
Cellule + matrice extracellulare
TESSUTO
TESSUTO
Porzione di materia vivente con aspetto
omogeneo presente con caratteristiche simili in
varie sedi del corpo
ISTOLOGIA
Studio dei tessuti
4
POTERE DI RISOLUZIONE
distanza minima alla quale due
punti possono essere distinti come
entità separate
Occhio umano
PR:
100 mm
(0.1 mm)
200 nm (0.2mm)
0.4 nm
10 nm
5
MICROSCOPIA OTTICA
Consistenza
INCLUSIONE
Conservazione della struttura
FISSAZIONE
6
MICROSCOPIA OTTICA
Da pochi minuti ad 1-2 giorni
1- 2 ore per gradazione
Diafanizzazione
1- 2 ore per recipiente
Si fanno 2 – 3 cambi di xilolo per
eliminare tutto l’alcool
Formella
Qui viene versata la paraffina fusa
La paraffina viene versata all’interno di formelle di plastica o
rame di seguito, abbastanza velocemente, vengono allineati, i
pezzi da includere
7
MICROSCOPIA OTTICA
Inclusione
6-24 ore in totale
Si fanno 2-3 cambi per eliminare
tutto il solvente
Taglio
Il taglio delle
sezioni è effettuato
utilizzando il
microtomo
8
MICROSCOPIA OTTICA
Montaggio
Colorazione e montaggio
2’ per ogni recipiente
20-30” per alcool
Qui i vetrini possono rimanere per
un certo tempo
5’ -10’
Ematossilina 5’
1-2’ per X
Eosina 1’
Montaggio
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INCLUSIONE PER CONGELAMENTO
Vantaggi
•Maggiore rapidità
•Migliore conservazione delle
caratteristiche chimiche
Svantaggi
Danneggiamento della
morfologia dei tessuti
TAGLIO
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MICROSCOPIA OTTICA
FASI, OCCORRENTE, SCOPI E TEMPI NECESSARI PER L'ALLESTIMENTO
DI UN PREPARATO ISTOLOGICO
di organi o tessuti da studiare
PRELIEVO
forbici, pinzette, bisturi, lamette, piano di sughero o in materiale plastico
l’operazione va eseguita nel più breve tempo possibile
FISSAZIONE
Impedire la degenerazione dei tessuti per mantenere il più possibile inalterato il
quadro strutturale dei tessuti
Formalina neutra al 10%
Il tempo di soggiorno dei pezzi nel fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni
INCLUSIONE
Rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere affettato allo spessore
voluto (5-7 mm)
Serie di alcooli – Solvente del mezzo includente – Mezzo includente – Stufa a
56-60°C
Da alcune ore a 1-2 giorni
TAGLIO
Affettare il pezzo in modo da poter essere osservato al microscopio
Microtomo
MONTAGGIO
COLORAZIONE
MONTAGGIO
Disporre le sezioni su vetrini
Vetrini portaoggetto - Piastratermostata
Permettere l’osservazione della sezione al microscopio
Coloranti
Proteggere le sezioni e migliorare l’osservazione al micorscopio
Vetrini coprioggetto - Montante
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Ematossilina/Eosina
•
Ematossilina
•
Eosina
Porzioni cellulari
basofile
Colorante basico che ha
affinità per le molecole
cariche negativamente (DNA,
RNA ed alcune proteine)
Colorante acido che ha
affinità per le molecole
cariche positivamente
(proteine del citosol)
Alcuni esempi di
colorazioni
•
Esiste una grande varietà di coloranti
Questa tabella ne evidenzia
alcuni dei più comuni
PAS (Acido Periodico Schiff)
Dimostrazione della presenza di
carboidrati.
Tali strutture sono colorate in magenta
•
•
Impregnazione argentica o con oro
Per processi cellulari e
fibre delicate comprese
quelle nervose
Tricromica
Utilizzata per evidenziare le fibre
connettivali
e per distinguerle da quelle muscolari
•
Porzioni cellulari
acidofile
Sudan black o osmio
Per lipidi/mielina
I lipidi non incorporano coloranti
acquosi
•
May-Grünwald-Giemsa
Per l’esame di
strisci di sangue
e di midollo osseo
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Come si osserva il campione?
• Attraverso un buon microscopio ottico
• Fotografandolo
Interpretare il campione !!!!
Sezione
trasversale
Sezione
longitudinale
Sezione
obliqua
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Allestimento di uno striscio
COLORAZIONE
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MICROSCOPI
Permette di osservare
cellule e tessuti a fresco
A contrasto di fase
A interferenza
Fornisce
dati
quantitativi
Microscopio ottico
A fluorescenza
E’ in grado di rivelare e
localizzare molecole fluorescenti
Confocale
E’ in grado di mettere
a
15
fuoco piani diversi di un
preparato
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Membrana cellulare
RER
Granuli di
secrezione
Mitocondri
TEM
SEM
Entrambi basati sull’uso di un fascio di elettroni
Apparato di Golgi
Nucleo
SEM: • basato sul principio di una immagine riflessa derivante
dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del
campione
• permette la visione tridimensionale della superficie di
cellule e tessuti
TEM:
• Immagine derivata dall’attraversamento delle strutture
biologiche da parte degli elettroni
• permette lo studio della morfologia subcellulare
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Microscopio ottico
e
microscopio elettronico a
confronto
P.R. TEM: 2Å
Catodo: filamento
Anodo
Quando usare il microscopio elettronico?
La maggiore risoluzione del TEM permette di
visualizzare strutture non visibili con il
microscopio ottico
P.R. Occhio: 0.2 mm = 200 mm
Condensatore
Preparato
P.R. M. Ottico: 2000 Å = 200 nm
oculare
Obiettivo
Obiettivo
Proiettore
Sezione istologica
Lente del condensatore
Schermo
fluorescente
Sorgente luminosa:
lampada
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PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI PER TEM
1. Fissazione
2. Postfissazione
3. Disidratazione
Glutaraldeide tamponata a pH 7.2-7.8
Tetrossido di osmio
L’osmio agisce anche da “colorante” sia perché si lega come
osmio ridotto alle lipoproteine e ad altri costituenti delle
cellule sia perché l’osmio, a causa del suo elevato numero
atomico, aumenta la diffrazione degli elettroni da parte dei
costituenti cellulari, accentuandone il contrasto
Passaggi in soluzioni crescenti di etanolo
4. Inclusione
Resine epossidiche
5. Taglio
Ultramicrotomo
6. Montaggio
Retino
7. Colorazione Coloranti elettronici
8. Visualizzazione
TEM
Vetrino portaoggetto
Lama di diamante o di vetro
Sezioni che galleggiano in acqua
Spessore da 40 a 100 nm
Blu di toluidina
Microscopio ottico
Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini
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TEM
SEM
Catodo: filamento
Anodo
Condensatore
Preparato
Scanner
Obiettivo
Fascio di elettroni
Proiettore
Amplificatore elettronico
SCHERMO
Schermo
fluorescente
Preparato
Elettroni secondari
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MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE
• Minore potere di risoluzione rispetto al TEM
• Usato per studiare la superficie cellulare
• Consente di valutare il rilievo degli oggetti
• Fornisce una immagine tridimensionale della
superficie del campione
• Il campione non viene tagliato
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Come si prepara il campione per l’osservazione al SEM?
•
Acquisizione del campione
•
Fissazione e Disidratazione
•
No inclusione
•
Il campione viene poggiato su un supporto
•
Ricoperto con un metallo elettronconducente
•
Visualizzato
•
Fotografato
•
Analizzato ai raggi X
Il campione deve essere trattato con cura per non danneggiare la superficie
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Riassumendo ……
MO
TEM
1
1
lampadina
2
SEM
1
Filamento elettronico
ad alta tensione
2
1. Sorgente per l’illuminazione
2. Lente condensatore
3. Preparato
4. Obiettivo
5. Oculare
6. Proiettore
2
Lente di vetro
3
Vetrino portasezione
4
Lente di vetro
3
Lente
elettromagnetica
Retino portasezione
7. Sistema di deflessione del
fascio
4
Lente
elettromagnetica
4
5
Lente di vetro
6
Schermo TV
3
OCCHIO
SCHERMO FLUORESCENTE
Immagine riflessa
***
8. Fotomoltiplicatore
Blocchetto metallizzato
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Istologia “funzionale”
• Istocitochimica
- Si prefigge di localizzare particolari molecole
impiegando reazioni chimiche specifiche
• Immunoistochimica
- Permette di dimostrare la presenza di specifiche
sostanze nei tessuti utilizzando anticorpi
• Citometria a flusso
L’istologia moderna non si
limita all’osservazione
descrittiva degli aspetti
morfologici e strutturali di
base di cellule e tessuti.
- Permette di misurare alcuni parametri
morfologici
• Autoradiografia
- Permette di approfondire le conoscenze della
fisiologia cellulare
• Colture cellulari
Esistono numerose tecniche
che consentono di rispondere
a quesiti su aspetti funzionali
della composizione di un
tessuto
- Permette studio e osservazione delle cellule
viventi
• Biologia molecolare
- NORTHERN BLOTTING
- Permette di definire quali geni sono espressi
da un tipo cellulare o tessuto
• IBRIDAZIONE In Situ
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- Permette di localizzare RNAm per specifiche
proteine
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