Dipartimento di Scienze Biomediche - Sezione Embriologia Medica - Università di Catania Corso di Istologia ed Embriologia – polo B - Testi Consigliati: • Istologia di V. Monesi Ed. Piccin • Larsen - Embriologia Umana - Ed. Gnocchi o • Barbieri - Carinci – Embriologia – Casa Editrice Ambrosiana Dr. Imbesi Rosa 1 Materia Vivente= Tutto ciò che ha la capacità di riprodursi o di replicarsi • UNITA’ DI MISURA DI LUNGHEZZA: - micrometro (mm) = 10-3 mm - nanometro (nm) = 10 -3 mm - Angstrom (Å) = 10 -1 nm • UNITA’ DI PESO: - milligrammo (mg) = 10-3 g - microgrammo (mg) = 10-6 g - nanogrammo (ng) = 10-9 g - picogrammo (pg) = 10-12 g • Dalton = unità di massa molecolare 2 Corrisponde al peso dell’atomo di idrogeno considerato come unità LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLA SOSTANZA VIVENTE Virus, viroidi e prioni Cellula vegetale Procarioti Batteri Cellula animale Alghe batterio unicellulari Eucarioti pluricellulari Protozoi Protofiti virus ribosoma Proteina globulare aminoacidi 3 atomo CELLULA La più piccola unità vivente Cellula Cellula Cellule Cellule + matrice extracellulare TESSUTO TESSUTO Porzione di materia vivente con aspetto omogeneo presente con caratteristiche simili in varie sedi del corpo ISTOLOGIA Studio dei tessuti 4 POTERE DI RISOLUZIONE distanza minima alla quale due punti possono essere distinti come entità separate Occhio umano PR: 100 mm (0.1 mm) 200 nm (0.2mm) 0.4 nm 10 nm 5 MICROSCOPIA OTTICA Consistenza INCLUSIONE Conservazione della struttura FISSAZIONE 6 MICROSCOPIA OTTICA Da pochi minuti ad 1-2 giorni 1- 2 ore per gradazione Diafanizzazione 1- 2 ore per recipiente Si fanno 2 – 3 cambi di xilolo per eliminare tutto l’alcool Formella Qui viene versata la paraffina fusa La paraffina viene versata all’interno di formelle di plastica o rame di seguito, abbastanza velocemente, vengono allineati, i pezzi da includere 7 MICROSCOPIA OTTICA Inclusione 6-24 ore in totale Si fanno 2-3 cambi per eliminare tutto il solvente Taglio Il taglio delle sezioni è effettuato utilizzando il microtomo 8 MICROSCOPIA OTTICA Montaggio Colorazione e montaggio 2’ per ogni recipiente 20-30” per alcool Qui i vetrini possono rimanere per un certo tempo 5’ -10’ Ematossilina 5’ 1-2’ per X Eosina 1’ Montaggio 9 INCLUSIONE PER CONGELAMENTO Vantaggi •Maggiore rapidità •Migliore conservazione delle caratteristiche chimiche Svantaggi Danneggiamento della morfologia dei tessuti TAGLIO 10 MICROSCOPIA OTTICA FASI, OCCORRENTE, SCOPI E TEMPI NECESSARI PER L'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO di organi o tessuti da studiare PRELIEVO forbici, pinzette, bisturi, lamette, piano di sughero o in materiale plastico l’operazione va eseguita nel più breve tempo possibile FISSAZIONE Impedire la degenerazione dei tessuti per mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessuti Formalina neutra al 10% Il tempo di soggiorno dei pezzi nel fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni INCLUSIONE Rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere affettato allo spessore voluto (5-7 mm) Serie di alcooli – Solvente del mezzo includente – Mezzo includente – Stufa a 56-60°C Da alcune ore a 1-2 giorni TAGLIO Affettare il pezzo in modo da poter essere osservato al microscopio Microtomo MONTAGGIO COLORAZIONE MONTAGGIO Disporre le sezioni su vetrini Vetrini portaoggetto - Piastratermostata Permettere l’osservazione della sezione al microscopio Coloranti Proteggere le sezioni e migliorare l’osservazione al micorscopio Vetrini coprioggetto - Montante 11 Ematossilina/Eosina • Ematossilina • Eosina Porzioni cellulari basofile Colorante basico che ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine) Colorante acido che ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol) Alcuni esempi di colorazioni • Esiste una grande varietà di coloranti Questa tabella ne evidenzia alcuni dei più comuni PAS (Acido Periodico Schiff) Dimostrazione della presenza di carboidrati. Tali strutture sono colorate in magenta • • Impregnazione argentica o con oro Per processi cellulari e fibre delicate comprese quelle nervose Tricromica Utilizzata per evidenziare le fibre connettivali e per distinguerle da quelle muscolari • Porzioni cellulari acidofile Sudan black o osmio Per lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi • May-Grünwald-Giemsa Per l’esame di strisci di sangue e di midollo osseo 12 Come si osserva il campione? • Attraverso un buon microscopio ottico • Fotografandolo Interpretare il campione !!!! Sezione trasversale Sezione longitudinale Sezione obliqua 13 Allestimento di uno striscio COLORAZIONE 14 MICROSCOPI Permette di osservare cellule e tessuti a fresco A contrasto di fase A interferenza Fornisce dati quantitativi Microscopio ottico A fluorescenza E’ in grado di rivelare e localizzare molecole fluorescenti Confocale E’ in grado di mettere a 15 fuoco piani diversi di un preparato MICROSCOPIA ELETTRONICA Membrana cellulare RER Granuli di secrezione Mitocondri TEM SEM Entrambi basati sull’uso di un fascio di elettroni Apparato di Golgi Nucleo SEM: • basato sul principio di una immagine riflessa derivante dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del campione • permette la visione tridimensionale della superficie di cellule e tessuti TEM: • Immagine derivata dall’attraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni • permette lo studio della morfologia subcellulare 16 Microscopio ottico e microscopio elettronico a confronto P.R. TEM: 2Å Catodo: filamento Anodo Quando usare il microscopio elettronico? La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico P.R. Occhio: 0.2 mm = 200 mm Condensatore Preparato P.R. M. Ottico: 2000 Å = 200 nm oculare Obiettivo Obiettivo Proiettore Sezione istologica Lente del condensatore Schermo fluorescente Sorgente luminosa: lampada 17 PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI PER TEM 1. Fissazione 2. Postfissazione 3. Disidratazione Glutaraldeide tamponata a pH 7.2-7.8 Tetrossido di osmio L’osmio agisce anche da “colorante” sia perché si lega come osmio ridotto alle lipoproteine e ad altri costituenti delle cellule sia perché l’osmio, a causa del suo elevato numero atomico, aumenta la diffrazione degli elettroni da parte dei costituenti cellulari, accentuandone il contrasto Passaggi in soluzioni crescenti di etanolo 4. Inclusione Resine epossidiche 5. Taglio Ultramicrotomo 6. Montaggio Retino 7. Colorazione Coloranti elettronici 8. Visualizzazione TEM Vetrino portaoggetto Lama di diamante o di vetro Sezioni che galleggiano in acqua Spessore da 40 a 100 nm Blu di toluidina Microscopio ottico Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini 18 TEM SEM Catodo: filamento Anodo Condensatore Preparato Scanner Obiettivo Fascio di elettroni Proiettore Amplificatore elettronico SCHERMO Schermo fluorescente Preparato Elettroni secondari 19 MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE • Minore potere di risoluzione rispetto al TEM • Usato per studiare la superficie cellulare • Consente di valutare il rilievo degli oggetti • Fornisce una immagine tridimensionale della superficie del campione • Il campione non viene tagliato 20 Come si prepara il campione per l’osservazione al SEM? • Acquisizione del campione • Fissazione e Disidratazione • No inclusione • Il campione viene poggiato su un supporto • Ricoperto con un metallo elettronconducente • Visualizzato • Fotografato • Analizzato ai raggi X Il campione deve essere trattato con cura per non danneggiare la superficie 21 Riassumendo …… MO TEM 1 1 lampadina 2 SEM 1 Filamento elettronico ad alta tensione 2 1. Sorgente per l’illuminazione 2. Lente condensatore 3. Preparato 4. Obiettivo 5. Oculare 6. Proiettore 2 Lente di vetro 3 Vetrino portasezione 4 Lente di vetro 3 Lente elettromagnetica Retino portasezione 7. Sistema di deflessione del fascio 4 Lente elettromagnetica 4 5 Lente di vetro 6 Schermo TV 3 OCCHIO SCHERMO FLUORESCENTE Immagine riflessa *** 8. Fotomoltiplicatore Blocchetto metallizzato 22 Istologia “funzionale” • Istocitochimica - Si prefigge di localizzare particolari molecole impiegando reazioni chimiche specifiche • Immunoistochimica - Permette di dimostrare la presenza di specifiche sostanze nei tessuti utilizzando anticorpi • Citometria a flusso L’istologia moderna non si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. - Permette di misurare alcuni parametri morfologici • Autoradiografia - Permette di approfondire le conoscenze della fisiologia cellulare • Colture cellulari Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su aspetti funzionali della composizione di un tessuto - Permette studio e osservazione delle cellule viventi • Biologia molecolare - NORTHERN BLOTTING - Permette di definire quali geni sono espressi da un tipo cellulare o tessuto • IBRIDAZIONE In Situ 23 - Permette di localizzare RNAm per specifiche proteine