Dalle biotecnologie
all’ingegneria genetica
CAPITOLO
9
Indice
1. Le biotecnologie: ieri e oggi
2. La tecnologia del DNA ricombinante
3. Produzione di proteine
4. Identificazione di un gene di DNA
5. La reazione a catena della polimerasi: la PCR
6. Sequenziamento del DNA (secondo Sanger)
7. Libreria genomica e libreria a cDNA
8. Analisi dell’espressione genica con microarray
9. Genomica e Proteomica
10. Gli anticorpi monoclonali
11. Gli RNA
12. Tecnologia delle cellule staminali
13. Clonazione
14. Terapia genica
15. Vaccini e anticorpi
16. Animali transgenici
17. Gli OGM: piante transgeniche
18. Le biotecnologie e le loro applicazioni
19. Biotecnologie ambientali
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© Istituto Italiano Edizioni Atlas
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Le biotecnologie: ieri e oggi
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Per biotecnonologie s’intendono tutte quelle tecniche che utilizzano cellule vive
per ottenere prodotti utili all’uomo.
Per migliaia di anni si è fatto il pane, il vino, la birra, tutti processi biotecnologici,
senza sapere nulla della genetica, della biochimica e della fisiologia.
A metà del Novecento, si ha lo sviluppo dell’ingegneria genetica: consiste di un
insieme di tecniche, derivate dalla biologia molecolare, che permettono di
manipolare il genoma di un organismo vivo e di trasferirlo da una specie ad
un’altra.
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Le biotecnologie: ieri e oggi
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Si possono creare nuove specie, correggere i difetti genetici, produrre numerosi
composti. L’ingegneria genetica permette di selezionare un gene e di trasferirlo nel
DNA di una varietà commerciale.
Gli organismi che hanno subito modificazioni
mediante l’ingegneria genetica prendono il
nome di organismi transgenici.
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La tecnologia del DNA
ricombinante
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Con la tecnologia del DNA ricombinante è possibile ottenere molte copie di un
gene. Per operare con questa tecnica si devono seguire questi passaggi:
a. Isolare il gene da cellule umane;
b. Estrarre il plasmide dai batteri (escherichia coli).
Per estrarre il gene umano il DNA viene tagliato con gli
enzimi di restrizione (forbici molecolari). Questi stessi
enzimi devono essere utilizzati per tagliare il plasmide in un
solo punto.
Il DNA umano e il plasmide devono essere tagliati con gli
stessi enzimi da restrizione in modo che le loro estremità
siamo complementari.
L’unione del gene umano con il plasmide si realizza mediante
un enzima chiamato DNA-ligasi.
Il risultato è una molecola di DNA ricombinante che, una volta
introdotto nel batterio, si moltiplicherà producendo molte
copie del DNA ricombinante (clonazione del DNA).
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Produzione di proteine
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Uno degli esempi
più noti delle
tecnica del DNA
ricombinante è la
produzione
dell’insulina.
Con la tecnica del DNA ricombinante vengono prodotte, oltre all’insulina,
numerose altre sostanze:
− l’ormone della crescita;
− il fattore VIII della coagulazione;
− l’interferone;
− i vaccini.
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Identificazione di un gene di DNA
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Il DNA genomico, dopo che è stato estratto da una cellula, viene trattato con un
conveniente enzima di restrizione. I frammenti che si ottengono sono separati
mediante elettroforesi su agarosio.
Per individuare nel gel la banda di DNA che presenta il gene da clonare, nel 1975
Edward Southern suggerì una tecnica, chiamata Southern Blotting (blotting in
inglese significa assorbimento) dal nome del suo scopritore.
I frammenti di DNA, separati con l’elettroforesi vengono ricoperti da carta
assorbente e da una membrana.
I frammenti vengono assorbiti dalla carta e trasferiti alla membrana. Solo allora
vengono esposti ad una sonda di DNA fluorescente e mediante ibridazione essere
individuati.
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La reazione a catena
della polimerasi: la PCR
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Per ottenere molte copie di un gene la tecnica del clonaggio del DNA implica
l’inserimento del gene in cellule viventi batteriche che, a loro volta, replicano il gene
con il proprio DNA durante le fasi di divisione e di replicazione.
Il processo della PCR, sviluppato dal chimico Kary Mullis nel
1985, invece, si svolge in una singola provetta mescolando
semplicemente DNA con una serie di reagenti e ponendo la
provetta in un termociclatore (foto a destra). Questo
apparecchio, mediante una serie ripetuta di riscaldamento e di
raffreddamento, permette di ottenere in poche ore, anche con
una piccola quantità di DNA iniziale, milioni di copie di un gene.
Applicazioni della PCR
La reazione a catena della polimerasi ha molte aree
di applicazione in chimica, genetica e biologia.
Questa tecnica trova anche applicazioni in
criminologia perché permette di rivelare o identificare
frammenti di DNA che possono individuare uno
specifico individuo.
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Sequenziamento del DNA
(secondo Sanger)
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ALL’INGEGNERIA GENETICA
Frederick Sanger e collaboratori svilupparono un metodo detto metodo dei terminatori
di catena (chain terminator method), o metodo di Sanger, che gli valse il secondo
premio Nobel.
Questa tecnica permette di sequenziare il DNA, cioè di determinare l’esatta sequenza
dalle basi in un frammento di DNA a singolo filamento.
Per leggere il gene, per prima cosa il genetista deve copiarlo. Per tale scopo procede
allo stesso modo della replicazione del DNA.
Il metodo Sanger richiede i seguenti componenti:
− Copie del gene a singolo filamento da leggere.
− Primers di DNA (oligonucleotidi a singolo filamento di 20-30 basi) marcati con sostanza
fluorescente.
− Una elevata quantità dei quattro componenti del DNA, i deossiribonucleotiditrifosfato:
A, T, G, C (dNTP).
− La Taq DNA polimerasi, l’enzima che sintetizza DNA.
− Quattro nucleotidi modificati (di-deossiribonucleotiditrifosfato), chiamati terminatori
e indicati con ddNTP, nei quali sul carbonio 3’ del ribosio vi è la presenza di un H al posto
di OH. A causa di questa sostituzione, la reazione di polimerizzazione che porta alla
sintesi della catena viene bloccata.
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Libreria genomica
e libreria a cDNA
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Una libreria genomica è un insieme di cloni che contiene una copia di ogni singolo gene
presente nel DNA di un particolare organismo.
Una libreria genomica è una collezione di cloni che rappresentano l’intero genoma di un
organismo.
L’identificazione del clone contenente il gene a cui si è interessati si esegue mediante sonde.
Una libreria a cDNA, invece, contiene solo i geni espressi in una cellula.
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Analisi dell’espressione
genica con microarray
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La tecnologia dei microarray a DNA, noti anche come DNA chip, permette l’analisi
dell’espressione dei geni di un genoma (trascrittoma) e, quindi, lo studio sistematico
dell’espressione genica di un tessuto o di un organismo.
La biologia molecolare tradizionale analizzava un
gene alla volta, mentre la tecnologia dei microarray
analizza contemporaneamente l’attività di migliaia
di geni.
In particolare consente di studiare i cDNA di una
cellula, cioè quali geni di cellula sono espressi.
In questo chip a DNA sono
contenute le sonde che permettono
di analizzare l’espressione dei geni
di un genoma.
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Genomica e Proteomica
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
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La genomica è la conoscenza completa del genoma e le interazioni che legano i
geni che lo compongono.
L’insieme delle proteine prodotte dal genoma prende il nome di proteoma.
La proteomica è la disciplina che studia l’insieme completo di proteine codificate
dal genoma di un organismo.
Ad organismi geneticamente identici, ma con diverso proteoma, corrispondono
fenotipi differenti.
Girino e rana derivano dallo stesso genoma ma mostrano fenotipi diversi, cioè caratteri
morfologici differenti.
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10 Gli anticorpi monoclonali
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Quando sostanze estranee, batteri, virus, funghi, entrano nel nostro organismo, i
globuli bianchi (linfociti) del nostro sistema immunitario si attivano creando
“anticorpi” che colpiscono queste sostanze estranee (antigeni). I linfociti B del
nostro organismo riescono a neutralizzare l’agente patogeno perché sulla superficie
dell’antigene è presente una struttura che lo caratterizza.
Un sistema vivente, sotto lo stimolo di un antigene, dà luogo ad una miscela
eterogenea di anticorpi. Questi sono prodotti da differenti tipi di cellule immunitarie
(linfociti B), per cui sono noti come anticorpi policlonali.
Per utilizzare un singolo anticorpo contro il suo antigene specifico sono stati creati
anticorpi monoclonali, cioè anticorpi altamente specifici, che possono attaccare un
solo particolare antigene.
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11 Gli RNA
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Il concetto chiave della biologia molecolare ammette che per la traduzione dei geni è
necessaria la presenza di un intermediario, l’acido ribonucleico (RNA).
L’RNA presenta una struttura simile al DNA ma, come sappiamo, è formato da un
solo filamento. È l’RNA messaggero (mRNA) che si traduce in proteine.
La tecnologia antisenso
Con la terapia antisenso si introduce nella cellula un filamento di RNA complementare
a quello dell’mRNA che produce la proteina responsabile di una malattia.
In seguito all’accoppiamento dei due filamenti, l’mRNA non può legarsi al ribosoma e,
quindi, la proteina non viene prodotta.
RNA interfering
L’RNA interfering (RNAi) si presenta molto simile all’interferenza antisenso, anche
se offre un potenziale terapeutico molto più promettente.
Con questa tecnica non si verifica la traduzione del gene che determina il quadro
clinico negativo perché viene silenziata l’espressione del gene. La siRNA produce la
distruzione degli mRNA prima che possano convertirsi in una proteina.
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12 Tecnologia delle cellule staminali
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Le cellule staminali sono cellule che hanno la capacità di dividersi e, rispetto ad altri
tipi di cellule, possono specializzarsi.
Esistono due tipi di cellule staminali: le adulte e le embrionali.
Il corpo di ogni essere umano è costituito da cellule
staminali adulte (AS). Queste possono differenziarsi in
diversi tipi cellulari di una stessa classe di cellule.
Quando una cellula staminale AS, che è solo parzialmente
differenziata, riceve l’ordine di dividersi in due cellule, una di
esse si mantiene staminale mentre l’altra diventa una cellula
normale che si specializza in un particolare tessuto.
Le cellule staminali embrionali (ES) non sono specializzate. Esse possono con la
divisione cellulare differenziarsi in tutti i tipi di cellule specializzate presenti nel nostro
corpo: muscolari, nervose, ossee, epiteliali.
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13 Clonazione
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
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Con il metodo della clonazione viene creata una copia, geneticamente identica, di
un animale o di una pianta.
Nel 1997, gli esperimenti condotti da
Ian Wilmut e dai suoi collaboratori,
presso il Roslin Institute, in Scozia,
portarono alla nascita di un clone,
mediante la tecnica del trasferimento
nucleare, una pecora chiamata Dolly.
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14 Terapia genica
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La ricerca di base della medicina genetica si è posta tra i suoi obiettivi quella di
trovare la cura per le malattie che presentano alterazioni nei geni.
La terapia genica è applicabile solo alle malattie che dipendono da un unico gene.
Con la terapia genetica un gene sano viene integrato nel DNA della cellula inferma.
La terapia genica può creare danni. Per esempio, il virus che deve introdurre il
gene intatto nel genoma difettoso può indurre una reazione immunitaria che, in
qualche caso, è causa di morte del paziente.
Presenta anche altri inconvenienti: in certe condizioni, si può avere inattivazione di
un gene funzionale e anche lo sviluppo di un cancro. Ciò è dovuto al fatto che il
gene introdotto si lega in una posizione aleatoria.
Per questi motivi la terapia genica incontra qualche resistenza nell’applicazione
clinica.
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15 Vaccini e anticorpi
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In medicina viene ricordato che è “meglio prevenire che curare”.
Questo è particolarmente valido per presidi terapeutici come le vaccinazioni.
Queste, infatti, ci proteggono da malattie gravi, potenzialmente anche mortali, e
costituiscono uno dei più efficaci mezzi di prevenzione a disposizione della sanità
pubblica.
Cosa contengono e come funzionano i vaccini
La vaccinazione può essere di due tipi: passiva e attiva.
Nella vaccinazione passiva si iniettano anticorpi che circolano nell’organismo per un
tempo definito (settimane o mesi), cioè il tempo necessario per proteggere la persona
vaccinata. In questa vaccinazione non si formano cellule memoria che possano reagire
immediatamente ad una infezione dopo anni. È quindi una vaccinazione di emergenza,
ad esempio, quella influenzale.
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15 Vaccini e anticorpi
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ALL’INGEGNERIA GENETICA
Nella vaccinazione attiva si iniettano
nell’organismo agenti patogeni vivi ma indeboliti
(attenuati) oppure frammenti di agenti patogeni
(antigeni) manipolati in laboratorio con l’ingegneria
genetica.
Esempi di vaccini attenuati sono il Sabin contro la
poliomielite e il vaccino contro il morbillo, la
pertosse e la rosolia.
Virus della poliomielite osservato
al microscopio elettronico.
Con la vaccinazione attiva si ha produzione di
anticorpi specifici e, nello stesso tempo, si
attivano le cellule memoria che entrano in azione
quando l’organismo, anche a distanza di anni, entra
in contatto con quell’agente patogeno.
La vaccinazione simula il primo contatto con
l’agente infettivo per stimolare il sistema immunitario
a produrre anticorpi specifici per quel particolare
microrganismo.
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Virus dell’epatite B osservato
al microscopio elettronico.
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16 Animali transgenici
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Per animale transgenico s’intende un animale in cui un gene inizialmente
estraneo, introdotto nella sua linea germinale, è portatore del carattere transgenico.
Gli animali transgenici sono utilizzati in campo biomedico per:
− studiare la funzione di geni specifici;
− utilizzare un mammifero come bioreattore nella produzione di proteine umane;
− correggere errori innati del metabolismo mediante terapia genica.
Si possono seguire due tecnologie per modificare un animale dal punto di vista genetico:
a. Microiniezione di uovo
fecondato (zigote).
Microiniezione di DNA
b. Manipolazione di cellule staminali embrionali (ES).
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17 Gli OGM: piante transgeniche
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ALL’INGEGNERIA GENETICA
Con l’acronimo OGM s’intendono Organismi Geneticamente Modificati.
Una tecnica utilizzata per preparare OGM è quella del trasferimento dei geni: si
prepara un plasmide contenente DNA esogeno che viene inserito nella cellula
batterica.
Nel momento in cui il DNA esogeno si integra nei cromosomi di una cellula
vegetale, questa si presenta trasformata.
La pianta del tabacco è stata la prima ad essere preparata mediante processi
biotecnologici.
La pianta del tabacco modificata
geneticamente è utilizzata per
ricerche in vari ambiti, tra i quali
la lotta all’inquinamento, la
produzione di antiparassitari
non tossici e la cura di malattie
gravi come l’AIDS.
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18 Le biotecnologie e le loro
applicazioni
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Le biotecnologie costituiscono un insieme di processi naturali e di ingegneria
genetica che vengono applicati in medicina, in agricoltura, nell’industria e nella
protezione ambientale.
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18 Le biotecnologie e le loro
applicazioni
CAPITOLO 9. DALLE BIOTECNOLOGIE
ALL’INGEGNERIA GENETICA
Con il passaggio dalle tradizionali tecnologie di fermentazione alle moderne
tecniche (DNA ricombinante, biochimica e biologia cellulare e molecolare) si sono
registrati notevoli benefici in tre aree che si possono così riassumere:
− industria applicata (medicine, enzimi, controllo dei cibi);
− ambiente (diagnostica degli inquinanti, prodotti per la prevenzione degli
inquinanti, biorimediazione);
− energia (combustibili da risorse rinnovabili).
Nell’industria chimica gli
enzimi, catalizzatori di
numerose reazioni,
trovano applicazione in
importanti prodotti.
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19 Biotecnologie ambientali
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ALL’INGEGNERIA GENETICA
Le biotecnologie ambientali utilizzano i microrganismi per conservare
l’ambiente e possono essere una importante risorsa per uno sviluppo sostenibile.
La biodegradazione di sostanze chimiche tossiche, il trattamento delle acque
inquinate e il biorisanamento (bioremediation) sono importanti tecniche che fanno
ricorso al metabolismo dei microrganismi.
Nel biorisanamento intervengono organismi
naturali per abbattere sostanze tossiche o
pericolose attraverso processi aerobici o
anaerobici.
Inquinamento marino
da idrocarburi.
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