ibridi

Considerazioni sulla
creazione
di cibridi-stemibridi-chimere
Cellula uovo con nucleo e cromosomi co, mitocondri
Spermatozoo con nucleo e cromosomi cs
co
cs
spermatozoo
fecondazione
Cellula uovo
co
co-cs
cocs
cs
cariogamia
zigote
Cellula uovo con nucleo e cromosomi co, mitocondri
Spermatozoo con nucleo e cromosomi cs
zigote
Mitocondri con proprio DNA
co-cs
Lo zigote possiede informazioni per lo sviluppo del nuovo individuo
contenute nei cromosomi di origine materna e paterna: co-cs
il patrimonio citoplasmatico
in particolare i mitocondri, sono solo di origine materna
I mitocondri sono sede delle reazioni che forniscono energia alla cellula
La loro moltiplicazione, attività,
dipendono da un equilibrato, corretto, rapporto
con le informazioni che li riguardano, provenienti dal DNA nucleare
Mitocondri con proprio DNA, mitocondriale
Nucleo con proprio DNA, nucleare
Zigote normale
Zigote con nDNA e mDNA interspecifici
donna1
capra
co-cs
donna2
pecora
Zigote con nDNA e mDNA intraspecifici
Per uno sviluppo normale dell’individuo, è necessario che il meccanismo
enzimatico di accoppiamento tra le reazioni dipendenti dal genoma nucleare
e il genoma mitocondriale siano perfettamente sintonizzate
Si sta cercando di comprendere la natura di tale meccanismo
anche creando degli ibridi cellulari con
genoma nucleare e genoma mitocondriale
appartenenti a specie diverse o uguali (ibridi interspecifici e intraspecifici)
Il numero di mitocondri presenti inizialmente (1000…) va riducendosi
nelle cellule embrionali (5-10…) e poi mediante moltiplicazione vanno
aumentando durante le fasi della
differenziazione cellulare, istogenesi,organogenesi.
Sono indispensabili per la vita della cellula
La trascrizione e replicazione del mDNA sono guidate da fattori
mitocondriali, codificati e prodotti dal nDNA , e trasferiti nei mitocondri
ove interagiscono con sequenze presenti nel mDNA non codificante
mDNA
nDNA
mDNA
mDNA
mDNA
La replicazione del mDNA cessa poco prima della fecondazione e riprende
allo stadio di blastocisti matura
(nell’uomo: circa 2 miliardi al secondo ! > durata media 100 giorni)
cibrido
ibrido citoplasmatico,
ottenuto inserendo un nucleo(diploide) di cellula somatica
in una cellula (denucleata)
della stessa specie (cibrido intraspecifico)
o di specie diversa (cibrido interspecifico)
Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri
denucleazione
Oocita ricevente, aploide, con propri mitocondri
Inserimento nucleo
Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2
il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nell’ovocita
ricevente, al quale è stato asportato il nucleo:lo zigote possiede il
DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente:
ibrido omoplastico
Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri
denucleazione
Oocita ricevente, aploide, con propri mitocondri
Inserimento nucleo e fusione citoplasmi
Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2
il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nell’ovocita
ricevente, al quale è stato asportato il nucleo:
vengono anche fusi i due citoplasmilo zigote possiede il
DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente
e della donatrice:ibrido eteroplasmatico
stembrido
ibrido citoplasmatico,
ottenuto inserendo un nucleo(diploide) di cellula somatica
in una cellula staminale embrionale (denucleata)
della stessa specie (stemibrido intraspecifico)
o di specie diversa (stemibrido interspecifico)
Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri
denucleazione
Cellule staminali embrionali riceventi, diploidi, con propri mitocondri
Inserimento nucleo in cellule staminali embrionali esistenti
Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2
il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nella
staminale ricevente, alla quale
è stato asportato il nucleo:la nuova cellula possiede il
DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente
Chimera:
embrione ottenuto disaggregando stadi embrionali precoci nei
singoli blastomeri e successivamente riaggregando i blastomeri di
specie diversa in percentuali variabili, allo scopo di studiare la biologia
dello sviluppo e la funzione specifica di determinati geni nella genesi
di particolari malattie
blastomeri1
blastomeri2
blastocisti
Aggregazione blastomeri
chimere
Impianto in utero
madre adottiva
In genere si può affermare che il numero di gravidanze a termine e di
nati vivi, nel caso di cibridi interspecifici, si verifica solo all’interno dello
stesso genere (tra bovini, tra ovini, tra equidi, tra felini)
Negli altri cibridi di diverso genere,
si arriva al massino allo stadio di blastocisiti:
es.mucca+cavallo, coniglio+macaco > blastocisiti
es.mucca+balena , maiale+coniglio << blastocisiti
Probabile cibrido ottenuto inserendo nucleo di linfocita umano in oocita
denucleato di bovino > linea staminale embrionale umana
Inserimento di nuclei di cellule somatiche umane , di vario tipo, in oociti
denucleati di anfibio( rana, xenopus) > riprogrammazione e riattivazione del
gene OCT-4 indicatore della potenzialità staminale richiamata nel nucleo
somatico differenziato
Importante riuscire a comprendere il meccamismo biochimico presente
nel citoplasma degli ovociti, capace di riprogrammare il DNA nucleare delle
cellule somatiche, differenziate
Sembra ormai certo che la riattivazione del sistema mitocondriale dipende
dal corretto trasferimento degli elettroni della catena respiratoria e questo
in funzione di 13 proteine, 2 rRNA, 22 RNA mitocondriali
e 67 prodotti codificafi nel DNA nucleare
Lo sviluppo embrionale risulta controllato inizialmente solo dal corredo
citoplasmatico ovulare (materno) mediante RNA messaggeri prodotti
dall’oocita: il genoma dello zigote si attiva solo allo stadio
di 2 blastomeri (topo),
4 blastomeri (uomo),
8 blastomeri (bovini, caprini).
Cibrido : nucleo somatico umano > oocita animale
a blastocisti avanzata, predominano prodotti genici umani, essendo stati
ormai degradati quelli animali presenti nell’oocita ricevente, eccetto
poche eventuali proteine
Importanza delle ricerche su ibridi
interspecfici e intraspecifici a livello umano
Ottenere linee di cellule staminali riprogrammando cellule somatiche
come se fossero staminali embrionali, senza ricorrere agli ovociti
Cercare di comprendere il meccanismo che nel citoplasma degli ovociti
permette di risvegliare il DNA differenziato e riportarlo allo stato di
totipotenza come se fosse una cellula embrionale totipotente
cellule staminali pluripotenti indotte, iPS : cellule somatiche adulte
riprogrammate alla pluripotenza staminale
Cellule iPS murine e umane sono state ottenute
da cellule somatiche differenziate adulte,
indotte a esprimere combinazioni di geni tipici di stadio staminale,
implicati nella promozione o mantenimento della pluripotenza
(es.fattori di trascrizione OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, Nanog, Lin28).
Cellula somatica umana differenziata
Cellule somatiche riprogrammate >staminali
Cellula somatica di topo differenziata
Le cellule, per es. fibroblasti della pelle, vengono
riprogrammate e acquistano una pluripotenzialità
staminale, con la capacità di generare tutti i tipi di
cellule differenziate, sia somatiche sia germinali.
Cellule iPS sono state successivamente ottenute da
cellule staminali neurali adulte murine e umane, mediante
l’espressione del solo fattore OCT4.
Fibroblasto, differenziato > fibroblasti
Fibroblasto riprogrammato
Cellula nervosa
Cellula ematica
Cellula germinale
Lo sviluppo di cellule iPS rappresenta un significativo
avanzamento non solo verso la comprensione della regolazione
epigenetica della trascrizione, per riprogrammare il
destino cellulare nelle cellule somatiche terminalmente
differenziate, ma anche verso la possibilità di generare
cellule staminali pluripotenti individualizzate, a partire
da cellule somatiche adulte, per trapianti terapeutici in vivo:
senza dover ricorrere alle cellule staminali di embrioni
ottenuti solo allo scopo di ottenere linee staminali da
utilizzare per le varie ricerche e terapie a diversi livelli
(problemi etici..)
Es.di applicazione del trasferimento di nucleo di cellula somatica di donna1
in ovocita di donna2, per aggirare il pericolo derivante da mitocondri
anomali della donna1 che desidera avere un figlio
Mitocondri alterati
Mitocondri normali
Asportazione del nucleo dell’ovocita di donna2
zigote
Inserimento del nucleo diploide di cellula somatica di donna1
Fecondazione in vitro con spermatozoo
Zigote: geneticamente possiede corredo di donna1 , mitocondri di donna2
ma con DNA senza influenza sulle caratteristiche dell’individuo
Cenni su alcune
caratteristiche
dell’uovo
Uovo : bioreattore capace di riprogrammare geneticamente il genoma
di cellule differenziate
Animali transgenizzati possono produrre uova contenenti nell’albume
molecole facilmente separabili e utilizzabili in terapie varie:
interferone umano, anticorpo monoclonale murino umanizzato contro
il melanomamaligno..
Possibile iniettare RNA messaggero di coniglio in uova di xenopus
(rana) per ottenere emoglobina di coniglio
Crioconservazione di spermatozoi e uova per problemi di
fecondazione assistita, utilizzazione futura per eventuali
fecondazioni in casi di
sterilità o trattamenti che pregiudicano la fertilità ecc.
Ricerche per riottenere la oogenesi in ovari non più ovulanti
Le uova presentano grande varietà di dimensioni (struzzo…mammiferi)
uova umane circa 200 micrometri
Uovo di gallina:citoplasma (tuorlo) suddiviso in citoplasma
formativo + nucleo: polo animale: ricco di mitocondri, ribosomi, RNAm
contribuisce alla formazione dell’embrione
nutritivo (vitello, lecite):polo vegetativo: lipidi,proteine:glicogeno:
contribuisce al nutrimento dell’embrione
guscio:costituito da proteine, fosfato di calcio, carbonato di calcio e
magnesio(albume:barriera protettiva, riserva di proteine,vitamine,H2O)
(guscio e albume forniti alla cellula uovo mentre attraversa l’ovidutto)
In funzione della quantità e distribuzione del lecite si distiguono uova:
telolecitiche (ricche di lecite…monotremi, gasteropodi, uccelli, rettili, anfibi, pesci)
oligolecitiche (povere di lecite..placentati, echinodermi)
mesolecitiche(poco lecite..anuri)
La distribuzione omogenea del citoplasma formativo porta alla formazione di
zigoti con blastomeri dotati di tutte le informazioni necessarie per sviluppare
un nuovo individuo(se vengono separate):uova regolatrici
la distribuzione ineguale genera zigoti a mosaico, con blastomeri dotati solo
di parte del corredo genetico:uova a mosaico
Fonte energetica importante:Ricco di proteine ad elevato potere nutritivo,
vitamine, fosfolipidi, minerali
Potere calorico basso 65 calorie/uovo gallina
Oogenesi umana: due ovari rivestiti d tonaca albuginea (connettivo) con
zona corticale (presenta oociti in vario stadio di maturazione)
zona midollare (presenta connettivo e vasi sanguigni)
Gli oogoni si moltiplicano per mitosi e si differenziano per meiosi durante
il periodo embrionale e parte di quello fetale:alla nascita sono presenti
vari tipi maturativi:la meiosi definitiva riprenderà, ciclicamente, alla
pubertà e continuerà fino alla menopausa ( circa 500 in circa 30 anni)
La meiosi comporta una doppia divisione con comparsa di una cellula
uovo (gamete) e 3 polociti o globuli polari: se avviene la fecondazione
si forma lo zigote che possiede il corredo cromosomico diploide tipico
della specie (46 cromosomi nell’uomo); se non avviene la fecondazione
l’uovo è destinato alla morte.
Nella partenogenesi si può ottenere uno zigote, diploide, mediante
l’assorbimento da parte dell’uovo, di un globulo polare:può essere
accidentale, facoltativa(api), ciclica(rotiferi)
telitoca > solo femmine:afidi, rotiferi
arrenotoca > solo maschi:api
deuterotoca > maschi e femmine