(B).

0
17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
Tabella 17.1
Polimorfismo enzimatico
nelle piante da frutto.
1
17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
Figura 17.1
Procedura per l’analisi
di marcatori enzimatici nelle piante.
2
17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
A
B
D
E
C
Figura 17.2
Marcatori biochimici: (A) fosfo-gluco-mutasi (PGM); (B) lipoossigenasi (LOX) in soia;
(C) esterasi (EXT) in poa pratense; (D,E) rappresentazioni schematiche di isoenzimi e
alloenzimi del sistema leucinoammino-peptidasi (LAP) e perossidasi (POX) in mais che
mettono in evidenza la tessuto-specificità di questi marcatori.
3
17.1 MARCATORI BIOCHIMICI
A
B
C
Figura 17.3
Rappresentazione schematica delle possibili combinazioni di catene polipeptidiche
e di profili elettroforetici ottenibili con enzimi monomerici (A), dimerici (B)
e tetramerici (C) in organismi diploidi.
4
17.2 MARCATORI MOLECOLARI:
DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI
Figura 17.4
Schema sinottico delle principali classi di marcatori molecolari
utilizzabili per l’analisi del genoma.
La classificazione adottata si basa sulla tecnica utilizzata
(SBH, Southern Blot Hybridization o PCR, Polymerase Chain
Reaction) e sul numero di loci saggiati (singolo-locus o multi-locus).
5
17.2 MARCATORI MOLECOLARI:
DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI
Figura 17.5
Spiegazione della natura dominante dei marcatori multi-locus
PCR-derivati e della natura codominante degli RFLP con sonde
locus-specifiche (  primer; — sonda; enzima di restrizione).
6
17.2 MARCATORI MOLECOLARI:
DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI
Tabella 17.2
Capacità di risoluzione dei gel di agarosio e poliacrilammide
in funzione della concentrazione di polimero.
7
17.2 MARCATORI MOLECOLARI:
DEFINIZIONE E CLASSIFICAZIONI
Gel di agarosio
orizzontale
Gel di
poliacrilammide
verticale
Colorazione con
bromuro di etidio
Colorazione con
nitrato di argento
Figura 17.6
Rappresentazione schematica di un sistema elettroforetico
orizzontale con gel di agarosio (A) e di uno verticale per gel di poliacrilammide (B).
8
17.3 MAPPE DI RESTRIZIONE
Figura 17.7
Mappatura di restrizione di un frammento di DNA
di 3 kb clonato in un plasmide.
9
17.3 MAPPE DI RESTRIZIONE
A
B
Figura 17.8
Mappe dei siti di restrizione identificati nella regione codificante
di un gene con informazioni relative agli enzimi di restrizione
e alla dimensione dei frammenti di restrizione (A)
oppure alla posizione e alla composizione delle sequenze di restrizione (B).
10
17.4 IBRIDAZIONE TIPO SOUTHERN BLOT (SBH)
Estrazione di
DNA genomico
Digestione con di
enzimi di restrizione
Figura 17.9
Procedura di
Southern Blot Hybridization.
Separazione mediante
elettroforesi
Trasferimento
su membrana
Ibridazione con
sonda marcata
Esposizione su
lastra radiografica
11
17.4 IBRIDAZIONE TIPO SOUTHERN BLOT (SBH)
A
Figura 17.10
Risultati di una analisi elettroforetica
di sei campioni di DNA genomico
di Medicago sativa integri e digeriti
con tre diversi enzimi di restrizione
(HindIII, BamHI e EcoRI) (A)
e ibridati con una sonda specifica per
una β-tubulina (B).
B
12
17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Figura 17.11
Schema di PCR: ogni ciclo prevede la denaturazione del DNA stampo,
l’ibridazione dei primer e la polimerizzazione dei nuovi filamenti.
13
17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
A
B
C
Figura 17.12
Numero delle molecole di DNA sintetizzate in relazione al numero di cicli di PCR (A);
rappresentazione schematica dell’amplificazione di una molecola di DNA (B)
e grafico che mostra l’incremento della quantità di DNA (C).
14
17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Tabella 17.3
Relazione tra efficienza (E)
di PCR e numero di copie.
15
17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Figura 17.13
Risultato dell’analisi elettroforetica di prodotti di amplificazione
originati mediante PCR con primer specifici per un determinato gene
(M = marcatori di peso molecolare).
16
17.5 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Tabella 17.4
Nomenclatura usata per le degenerazioni.
17
17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI
SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.14
Procedura per l’analisi di marcatori RFLP.
18
17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI
SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.15
(A) Natura del polimorfismo RFLP;
(B) natura del polimorfismo VNTR.
19
17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI
SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
A
B
Figura 17.16
Esempi di profili RFLP
Ottenuti con sonde singolo-locus
in una popolazione segregante (A, B)
e con sonda multi-locus (C).
C
20
17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI
SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
MARCATORI RFLP
Figura 17.17
Esempi di polimorfismi VNTR dovuti alla successione di un numero variabile
di elementi ripetuti compresi tra due siti di restrizione.
21
17.6 MARCATORI MOLECOLARI BASATI
SU TECNICHE DI RESTRIZIONE E IBRIDAZIONE
METODI DI MARCATURA DI SONDE E PRIMER
Figura 17.18
Marcatura radioattiva del DNA mediante nick
translation (A), random priming (B)
e procedura di DIG labeling (C).
22
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI RAPD e AP-PCR
Figura 17.19
Analisi di marcatori RAPD
con primer decamerici (10-mer) casuali.
23
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI RAPD e AP-PCR
Figura 17.20
Rappresentazione schematica della natura del polimorfismo
multi-locus dei marcatori RAPD (o AP-PCR).
24
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI RAPD e AP-PCR
A
B
C
D
Figura 17.21
Esempi di profili RAPD:
A) landrace di radicchio (primer OPA1);
B) popolazione segregante di mais (primer OP-B20);
C) linea inbred di mais (primer OP-C7);
D) landrace di radicchio (primer M13).
25
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Tabella 17.5
Elenco di SSR
analizzati nelle piante.
26
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.22
Confronto tra regioni di 50 kb
appartenenti ai genomi
di mais, uomo, lievito e E. coli
(modificata da: T.A. Brown
1999).
27
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Tabella 17.6
Frequenza e distribuzione
di microsatelliti nei genomi di alcune piante.
28
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.23
Analisi dei marcatori
microsatelliti (SSR).
29
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.24
Strategia per il clonaggio di SSR mediante costruzione
e screening di una libreria genomica.
30
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.25
Strategia per il clonaggio
di SSR mediante amplificazione
di frammenti di restrizione con primer
Inter-SSR in combinazione con primer AFLP.
31
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
Figura 17.26
(A) Natura del polimorfismo SSR:
i modelli di bande al locus microsatellite
sono diversi a seconda
della situazione allelica: l’individuo
eterozigote a/b mostra due bande
mentre quelli omozigoti a/a e b/b soltanto
una. (B) Natura del polimorfismo
Inter-SSR con primer ancorati in
5' oppure in 3'.
32
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SSR
A
C
B
D
E
Figura 17.27
Esempi di profili SSR in 15 cultivar di vite (A) originatesi per ibridazione tra Pinot nero (P)
e Gouais bianco (G) e in oltre 60 piante appartenenti ad una popolazione locale di mais
(Marano) (B). Esempi di profili SSR radioattivi e fluoresceinati (C, D). Rilevazioni di alleli
microsatelliti in genotipi omozigoti ed eterozigoti mediante analisi di frammenti con
sequenziatore (E).
33
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI I-SSR
Figura 17.28
Analisi di marcatori Inter-SSR (N=basi selettive).
34
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI I-SSR
A
B
Figura 17.29
Esempi di profili elettroforetici prodotti da marcatori Inter-SSR
in popolazioni locali di mais (A) e radicchio (B).
35
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI AFLP
Figura 17.30
Procedura per la rilevazione
di marcatori AFLP comprendente
la digestione del DNA con due distinti
enzimi di restrizione, la ligazione
di adattatori, la pre-amplificazione e
l’amplificazione finale con primer
aventi una o più basi selettive.
36
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI AFLP
Figura 17.31
Marcatori AFLP fluoresceinati:
polimorfismi genomici ottenuti
usando diverse combinazioni di
enzimi di restrizione/primer con due
o più basi selettive ciascuno
(foto: S. Ancillotti).
37
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI AFLP
A
B
Figura 17.32
Marcatori AFLP radioattivi:
(A) prova di primer condotta con combinazioni Eco/Mse aventi tre basi
selettive usando DNA genomico di poa pratense (P) ed erba medica (M);
(B) alleli marcatori AFLP segreganti in una popolazione sperimentale di mais.
38
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI M-SAP
Figura 17.33
Tecnica M-SAP:
attività degli enzimi HpaII e MspI
in relazione alla metilazione di entrambi
oppure di uno soltanto dei filamenti.
39
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SAMPL e M-AFLP
Figura 17.34
Analisi di marcatori SAMPL (A),
di marcatori M-AFLP (B)
e di marcatori S-SAP (C).
40
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SAMPL e M-AFLP
A
C
B
D
Figura 17.35
Esempi di profili SAMPL (A) generati in una popolazione segregante di Medicago sativa con
la combinazione di primer As1/Mse+AAC e di Microsatelliti-AFLP in Poa pratensis ottenuti
usando le combinazioni di primer Eco+CCA/CGCAA(CA)9 (B) e Eco+CAC/GCCAC(GCT)6 (C);
esempi di profili S-SAP (D) generati in una popolazione segregante di Medicago sativa con
il primer LTR-derivato Ret1 (5'-CGGTTTTGTGGGGTTGTGTTAGGCCA-3') in combinazione con
il primer Mse+ATC (foto: E. Albertini).
41
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI S-SAP
Figura 17.36
Esempi di profili TRAP:
i prodotti di amplificazione sono stati ottenuti
usando un primer AFLP (Eco+1 oppure Pst+1)
in combinazione con un primer degenerato
disegnato in una regione conservata (dominio)
di famiglie multigeniche (CDK, cicline, fattori delle
auxine, MADS box, tubuline, LRR) (foto: G. Galla).
42
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI STS
Figura 17.37
Procedura per lo sviluppo
di marcatori SCAR e CAPS.
Esempi di profili elettroforetici
generati da marcatori SCAR e CAPS.
43
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI STS
Figura 17.38
Tecnica di PCR inversa (inverse PCR).
44
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
INDICI INFORMATIVI DI POLIMORFISMO
Tabella 17.7
Valori di MI e AI in erba medica (Medicago spp.),
soia (Glycine max) e mais (Zea mays).
45
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Figura 17.39
Concetto di SNP:
allineamento multiplo di sequenze
che mostrano polimorfismo
dovuto a singoli nucleotidi.
46
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Figura 17.40
Rappresentazione grafica
di un aplotipo molecolare
basato su marcatori SNP.
47
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Tabella 17.8
Ripetizioni mononucleotidiche
del genoma cloroplastico
di alcune specie vegetali.
48
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Figura 17.41
Analisi SNP del genoma cloroplastico:
(A) esempi di polimorfismi visualizzati mediante elettroforesi;
(B) allineamento di sequenze con polimorfismi a carico di motivi mononucleotidici.
49
17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE
DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)
MARCATORI SNP
Tabella 17.9
Lista delle combinazioni di primer ccmp1-10
utili per studiare il polimorfismo di sequenze ripetute semplici
nel genoma cloroplastico delle angiosperme.
50
17.8 IBRIDAZIONE IN SITU CROMOSOMICA:
LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE GENICHE
A
B
Figura 17.42
Tecnica FISH:
schema di ibridazione e rilevazione del segnale sui cromosomi (A);
FISH multicolore (B).
51
17.8 IBRIDAZIONE IN SITU CROMOSOMICA:
LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE GENICHE
Tabella 17.10
Capacità di risoluzione della tecnica FISH
in ibridazioni con cromosomi metafasici, pachitenici e con fibre distese.
52
17.8 IBRIDAZIONE IN SITU CROMOSOMICA:
LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE GENICHE
Figura 17.43
Cariogramma di Medicago truncatula che mostra la distribuzione
di eucromatina e eterocromatina dei cromosomi del corredo di base
usando le informazioni acquisite mediante analisi FISH usando sonde isolate
da una libreria genomica (modificata da: O. Kulikova et al. 2001, Plant Journal).
53
17.9 IBRIDAZIONE IN SITU GENOMICA (GISH)
Figura 17.44
DNA genomico integro (G) e sonicato (S).
M=marcatori di peso molecolare (foto: S. Meneghetti).
54
17.9 IBRIDAZIONE IN SITU GENOMICA (GISH)
Figura 17.45
Ibridazione genomica in Brassica juncea
usando B. campestris e B. nigra
(fonte: J. Malaszynska et al. 2003, Intl. Polyploidy Conf.).
55
17.9 IBRIDAZIONE IN SITU GENOMICA (GISH)
Figura 17.46
Preparati di cromosomi pro-metafasici di salice bianco (A),
salice fragile (C) e di un loro ibrido (B). Risultati di esperimenti di
ibridazione in situ genomica (GISH) tra S. alba e S. fragilis (D, E),
tra S. alba e ibrido (F, G), tra S. fragilis e S. alba (H, I) e tra
S. fragilis e ibrido (J, K) (foto: S. Meneghetti e Hans de Jong).
56