Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
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Capitolo 8 Regolatori trascrizionali in procarioti: struttra e funzione
1. Fai riferimento ai contenuti online 8.1. Quando il fago SPO1
infetta Bacillus subtilis, il primo passo nel suo programma di
trascrizione prevede la trascrizione fagica dei geni precoci, tra
cui il gene 28 della polimerasi dell’ospite. Il prodotto di questo
gene, gp28, è un fattore sigma che si lega al core della
polimerasi dell’ospite causando uno switch dalla trascrizione dei
geni dell’ospite e dei geni fagici precoci, alla trascrizione dei
geni fagici intermedi tra cui gp33 e gp34. Questi due polipeptidi
fagici, gp33 e gp34, costituiscono un altro fattore sigma, che si
associa con la polimerasi dell’ospite per dirigere l’espressione
dei geni fagici tardivi.
2. Studi genetici e biochimici sostengono il modello della
trascrizione fagica di SPO1 di cui sopra. Fagi mutanti nel gene
28 perdono la capacità di passare dalla trascrizione dei geni
precoci a quella dei geni intermedi. Mutazioni in entrambi I geni
33 e 34 perdono la capacità di passare dalla trascrizione dei geni
intermedi a quella dei geni tardivi. Questo supporta l'idea che il
gene 28 è necessario per lo switch dei geni precoci in intermedi,
e che I geni 33 e 34 sono necessari per lo switch dei geni
intermedi in tardivi. Ulteriore conferma di questo modello
proviene da esperimenti di purificazione di Pero et al. circa una
serie di attività RNA-polimerasiche da cellule infettate con
SPO1. E 'stato dimostrato che una di queste, che contiene gp28,
è specifico per i geni fagici intermedi e l'altro, che contiene
gp33 e gp34, è specifico per i geni fagici tardivi.
3. Al fine di dimostrare che σE di B. subtilis riconosce il
promotore sporulazione specifico di 0,4 kb, lì dove σA
riconosce un promotore di tipo vegetativo, potremo istituire il
seguente esperimento. Vorremmo progettare un plasmide che
porta un promotore ed un gene vegetativo, entrambi contenuti
all'interno di un frammento di restrizione di una certa
dimensione, diciamo di 2 kb. Il plasmide contiene anche
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all'interno un frammento di restrizione noto di una diversa
dimensione, diciamo di 0,8 kb, un secondo gene sotto il
controllo del promotore sporulazione-specifico di 0,4 kb.
Vorremmo quindi utilizzare questi plasmidi in un saggio di
trascrizione in vitro utilizzando nucleotidi radiomarcati, il core
dell’RNA polimerasi e σE o σA. Al fine di determinare quali
geni sono trascritti quando la polimerasi è associata con le
diverse subunità σ, faremo un Southern blot ed ibrideremo i
trascritti marcati con I prodotti della restrizione del plasmide. Ci
aspetteremo i seguenti risultati: I trascritti prodotti dall’RNA
polimerasi associata con la subunità σA ibridizzerebbe con il
frammento di restrizione di 2 kb. Ciò è dovuto al fatto che σA
regola la trascrizione dei geni vegetativi-specifici. I trascritti
generati dalla RNA polimerasi associata con la subunità σE
dovrebbero ibridare con il frammento di restrizione di 0,8 kb.
Questo è dovuto al fatto che la trascrizione del DNA è diretta
dal promotore sporulazione-specifico di 0,4 kb riconosciuto da
σE. Per l'attuale piano sperimentale e per I risultati ottenuti da
Losick e colleghi, vedi le figure 8.4 e 8.5.
4. B. subtilis altera il suo programma trascrizionale durante la
sporulazione tramite diversi fattori σ che si associano con il
nucleo della RNA polimerasi e dirigono l'espressione di geni
sporulazione specifici. Le sequenze del promotore che dirigono
l’espressione di geni sporulazione specifici sono distinti da
quelle sequenze del promotore i cui geni sono necessari per la
crescita vegetativa. Questi promotori sono riconosciuti da fattori
σ distinti. Ad esempio, σA riconosce specificamente i promotori
di geni necessari per il mantenimento dello stato vegetativo e
σA non è prodotto durante la sporulazione. Alcuni di questi
fattori σ associati con la sporulazione sono, σF, σE, σH, σC, e
σK. Il primo fattore σ prodotto durante il processo di
sporulazione è σF che avvia una serie di switches genetici che
agiscono in concerto per il controllo del programma di
trascrizione sporulazione-specifico.
5. Fai riferimento ai contenuti online 8.2. L’esperimento di
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trascrizione run-off può essere utilizzato per dimostrare che B.
subtilus σE trascrive specificamente geni sotto il controllo del
promotore di spoIID. In questo esperimento si utilizza un
frammento di DNA contenente il promotore di spoIID sotto la
direzione del gene spoIID troncato ad una distanza nota dal sito
di inizio della trascrizione. Questo ci permetterà di prevedere la
dimensione del trascritto prodotto da questo gene. Potremo
istituire una reazione di trascrizione in vitro, in presenza di
nucleotidi radiomarcati e del nucleo della polimerasi associata a
differenti fattori σ. L’autoradiografia dimostrerà la presenza di
trascritti run-off solo quando spoIID è trascritto in presenza di
σE.
6. La risposta allo shock termico in E. coli è mediata da un
fattore sigma, σ32 (σH), un prodotto del gene rpoH. La presenza
di σ32 consente la trascrizione dei geni che codificano
chaperonine coinvolte nel refolding di proteine denaturate. Porta
anche alla trascrizione di geni che codificano per proteasi che
degradano le proteine aberranti. Mentre un aumento della
trascrizione di σ32 è innescato dallo shock termico, esistono
meccanismi alternativi per consentire un più rapido aumento
della quantità di σ32 disponibile per l'attivazione dei geni dello
shock termico. Uno di questi meccanismi è una maggiore
stabilità di σ32 dopo lo shock. σ32 è normalmente associato a
chaperonine che destabilizzano la proteina, ma immediatamente
dopo l'urto di calore queste chaperonine legano una grande
quantità di proteine cellulari e σ32 viene lasciato libero di
attivare I geni dello shock termico. Inoltre, l'elevata temperatura
aumenta l'efficienza con cui l’mRNA di rpoH viene tradotto.
Questo ha come risultato la fusione della struttura secondaria
della regione al 5 ' dell’mRNA.
7. Il fago T7 ha tre fasi trascrizionali chiamate I, II e III. Ci sono
5 geni di classe I e questi sono trascritti dalla RNA polimerasi
dell’ospite. Uno di questi codifica per una RNA polimerasi
fagica. Questa RNA polimerasi è altamente specifica per I geni
di classe II e III.
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8. Vedere la Figura 8.7. Il batteriofago λ compie lo switch della
trascrizione da precoce immediata a precoce ritardata fino alla
tardiva mediante gli antiterminatori. L'RNA polimerasi
dell’ospite trascrive I geni precoci immediati, cro ed N,
utilizzando i promotori PR e PL. L'mRNA prodotto da questi
promotori può essere esteso per comprendere le trascrizioni dei
geni precoci ritardati; ma questo è bloccato da una sequenza di
terminazione tra i geni precoci immediati ed I geni precoci
ritardati. N codifica per un antiterminatore che permette alla
polimerasi di leggere attraverso il terminatore. Cro codifica per
una proteina che sopprime il pathway lisogenico bloccando la
trascrizione del gene cI, che codifica per il repressore di λ
necessario per il mantenimento della lisogenia. I geni precoci
ritardati, O e P, codificano per le proteine necessarie per la
replicazione fagica. Il terzo gene dei precoci ritardati, Q, è un
altro antiterminatore e la sua produzione consente la trascrizione
dei geni tardivi. I geni tardivi sono trascritti dal promotore PR '.
In assenza di Q, la trascrizione da questo promotore è fermato
dopo 194 basi a causa di una sequenza di terminazione. La
presenza di Q consente alla polimerasi di by-passare questo
terminatore e di trascrivere i geni tardivi necessari per produrre
le proteine fagiche della testa e della coda.
9. Si vedano le figure 8,8 e 8,9. La chiave per la regia
dell’antiterminazione di λ in cellule di E. coli infettate dal fago
risiede in un sito chiamato nut (utilizzo di N) immediatamente a
valle del PL. Questo sito è distinto dalla sequenza di
terminazione alla fine del gene N. N proteina lega il sito nut sul
trascritto di mRNA ed un complesso di proteine, tra cui NusA,
legandosi alla polimerasi. La proteina N , quindi, si associa con
NusA e questo complesso di proteine associato con il sito nut
modifica la polimerasi così da leggere attraverso il terminatore
alla fine del gene N.
10. Vedere la Figura 8.10. Quando il complesso di allungamento
raggiunge la fine del gene N, rallenta a causa della presenza di
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una serie debole di coppie di basi UA nell’ibrido RNA / stampo.
Durante questa pausa la metà a monte della regione stelo-ansa
dell’RNA si lega al sito di legame a monte della RNA
polimerasi. La metà della regione ad ansa dell’RNA a monte
può essere rilasciata dall'RNA polimerasi e può formare
un’ansa. La formazione dell’ansa causa la destabilizzazione del
complesso di allungamento e la conseguente terminazione.
Pertanto, la terminazione è fortemente dipendente dalla velocità
e dall'efficienza di formazione dell’ansa, mentre il complesso di
allungamento è in pausa. Questo processo è influenzato dal
entrambe le proteine N e NusA. La presenza di NusA da solo
facilita la formazione dell’ansa. Indebolisce i contatti tra il sito
di legame della RNA polimerasi a monte, e la metà a monte
della putativa ansa nell’RNA, che le consenta di legare l’altra
sua metà. Questo stimola la terminazione. N contatta anche la
metà a monte della putativa ansa. Il legame di N elimina gli
effetti positivi di NusA ed ostacola piuttosto che stimolare la
formazione dell’ansa, inibendo così la terminazione. E’
interessante notare che NusA cambia il suo ruolo quando N è
presente. In presenza di N, NusA può inoltre impegnare la metà
a monte dell’ansa dove si formerà lentamente un’altra ansa.
11. Fai riferimento ai contenuti online 8.4. Un esperimento
dimostrerebbe che entrambi, N e NusA, contattano l'RNA, che
costituisce la prima o la prima metà a monte dell’ansa a gomito
sosterrebbe l'ipotesi che N e NusA controllano la formazione
dell’ansa nella terminazione intrinseca. Per dimostrare il legame
delle proteine all’RNA, possono essere usati esperimenti di UV
cross-linking. Siamo in grado di cross-linkare mediante UV un
RNA ad una proteina introducendo basi modificate nell’RNA.
Possiamo poi visualizzare le proteine marcate legate all’RNA
utilizzando PAGE e autoradiografia. In un esperimento di
questo tipo, si può utilizzare un mutante del terminatore che
produce un complesso lento di allungamento. Ciò faciliterà il
cross-linking dell’RNA alle proteine NusA ed N. Substrati
analoghi possono essere incorporati nella catena dell’RNA
seguendo l'allungamento del complesso lungo lo stampo. In
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questo modo siamo in grado di introdurre analoghi nelle
posizioni dell’RNA corrispondenti alla porzione a monte o a
valle dell’ansa. Questo RNA può essere incubato sia con N, con
NusA, o con entrambi, e può essere successivamente irradiato
per UV per consentire il cross-linking di qualsiasi proteina
legata alle regioni dell’RNA contenente gli analoghi del
ribonucleotide. Dai dati ci si aspetta che sia NusA, N, o che
entrambe insieme, possano essere cross-linkate a nucleotidi
nella posizione -24 corrispondente alla metà a monte dell’ansa a
gomito. Tuttavia, le proteine non possono essere legate alla
posizione -14, corrispondente alla metà a valle dell’ansa a
gomito. Questi dati, ottenuti da Gusarov e Nudler, sostengono
l'ipotesi che sia N e NusA contattano l'RNA, che costituisce la
prima o la metà a monte dell’ansa a gomito. Un esperimento
simile condotto da Gusarov e Nudler ha dimostrato che N
stimola il legame tra la metà a monte dell’ansa a gomito e le
subunità β e β' dell’RNA polimerasi; inoltre, N e NusA
stimolano ulteriormente questo legame, in accordo con l'ipotesi
che N e NusA collaborino per impedire la formazione dell’ansa,
e quindi evitare la terminazione della trascrizione a livello dei
terminatori intrinseci.
12. Vedere la Figura 8.12. Nonostante la sua incapacità a
riconoscere l'RNA polimerasi, il promotore PRE può dirigere la
trascrizione del gene CI. Questo è dovuto al fatto che CII si lega
debolmente al sito -35 del promotore ed aiuta il legame alla
RNA polimerasi, in modo da permettere alla trascrizione di
procedere.
13. Le basi contattate dalla RNA polimerasi nella regione -35
del promotore PRE sono sul lato opposto della doppia elica del
DNA rispetto a quelle basi nella stessa regione del DNA che
vengono contattate da CII. Così, si analizza il DNA da lati
opposti, CII ed RNA polimerasi possono legarsi
contemporaneamente ad una stessa regione di DNA.
14. Fai riferimento ai contenuti online 8.7. Il repressore di λ
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regola la propria sintesi sia in senso positivo e che negativo
come segue. In un λ lisogeno, I dimeri di repressore legano
preferenzialmente OR1 ed OR2. Questo legame vincolante
attiva l'espressione da PRM quindi regolando positivamente
l'espressione del repressore da cI. Non appena la concentrazione
del repressore aumenta, I siti di legame OR3 sono occupati e
questo inattiva l’espressione da PRM regolando negativamente
l'espressione di cI. Un esperimento di run-off in vitro può essere
usato per dimostrare questo fenomeno. Uno stampo di DNA è
stato progettato in modo da contenere OR, la regione che
controlla l’espressione verso sinistra di cI da PRM e
l’espressione verso destra di cro da PR. Possiamo sintetizzare i
trascritti marcati in presenza di quantità crescenti di repressore.
In un esperimento di questo tipo ci aspettiamo di osservare che a
basse concentrazioni di repressore vi è una stimolazione della
produzione del repressore da PRM, ma ad una concentrazione
più elevata di repressore vi è una diminuzione della produzione
di repressore da PMR. Inoltre, se si controlla la trascrizione di
cro in questo esperimento vedremo l'inibizione della trascrizione
di cro a basse concentrazioni di repressore e l'abolizione della
trascrizione di cro a concentrazioni di repressore più elevate.
15. L’esperimento genetico di soppressione intergenica si basa
sul principio per cui una mutazione in un gene, nel caso
specifico, di una subunità della polimerasi, sopprime la
mutazione in un altro gene, quello del repressore. L’assenza di
interazione tra polimerasi e repressore dovuta al repressore
mutante è resa possibile dalla mutazione compensatoria che
genera una subunità della polimerasi in grado di legare il
repressore mutato.
16. Fai riferimento ai contenuti online. Un soppressore
intergenico dell’esperimento può essere utilizzato per dimostrare
che il repressore di λ interagisce con la subunità σ della RNA
polimerasi di E. coli. In un esperimento di questo tipo, si utilizza
un repressore di λ mutato che non può stimolare la trascrizione
dal promotore PRM. Se questa perdita di attività è dovuta ad
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una perdita della capacità del repressore di interagire con l'RNA
polimerasi sul sito del promotore, si dovrebbe essere in grado di
isolare uno ceppo di E. coli con una mutazione compensativa
nella RNA polimerasi che consenta alll'interazione di avvenire e
di ripristinare la trascrizione dal promotore PRM. Tali mutazioni
sono rare, tuttavia, possiamo utilizzare una selezione positiva
per individuare solo le mutazioni desiderate. Vorremmo istituire
l'esperimento come segue. Utilizzando un profago, siamo in
grado di introdurre in E. coli, un gene cI recante una mutazione
che impedisca l’interazione del repressore con l'RNA polimerasi
sul sito del promotore PRM. Per selezionare mutanti di
compensazione della RNA polimerasi, possiamo introdurre un
secondo profago che porta un gene di resistenza per la
kanamicina (kanR) sotto la direzione del promotore PRM. Con
la crescita di E. coli su kanamicina, consentiamo solo la
sopravvivenza delle cellule con una mutazione di soppressione
della RNA polimerasi. La mutazione permette la trascrizione del
gene kanR dovuta al ripristino delle interazioni tra la RNA
polimerasi ed il repressore di λ. Per dimostrare che l'interazione
tra l’RNA polimerasi ed il repressore di λ coinvolge la subunità
σ della RNA polimerasi possiamo introdurre in cellule con il
costrutto del gene kanR, una collezione di geni mutanti rpoD
che codificano per le subunità-σ. Le linee cellulari kanamicina
resistenti che portano un gene mutante rpoD forniscono
l’evidenza che l'interazione tra l’RNA polimerasi ed il
repressore di λ coinvolge la subunità σ.
17. Vedere la Figura 8.16. La decisione di crescere in maniera
lisogena o litica è determinata in base alla quantità dei prodotti
dei geni cro e cI all'interno della cellula. cI produce il repressore
di λ, la cui presenza determina lisogenia ed è incompatibile con
il ciclo litico. La proteina cro inibisce la trascrizione dal gene cI,
mentre al tempo stesso, induce la trascrizione del suo stesso
gene e dei geni necessari per il ciclo litico. Se cI predomina, la
lisogenia è garantita; se predomina cro, la lisogenia è inibita ed è
garantito il ciclo litico. Due promotori importanti nel controllare
l'espressione di questi geni sono PRM e PR. Il promotore PRM
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dirige verso sinistra la trascrizione di cI, ed il promotore PR
dirige verso destra la trascrizione di cro. La lotta tra cI e cro per
l’infezione lisogenica o litica è in parte un riflesso del fatto che
lo stesso operatore tripartito controlli l'espressione di entrambi i
promotori. Entrambi cro e cI riconoscono l'operatore che ha tre
siti di legame, OR1, OR2 e OR3. La proteina cI ha la sua
maggiore affinità per OR1 ed il legame del repressore ad OR1
conduce al legame cooperativo di OR2. Se il repressore è
presente si lega ad OR1 ed ad OR2 ed induce l’espressione di cI
dal promotore PRM. Così, il repressore di λ mantiene la propria
espressione. Mentre l’espressione da PRM è indotta, vi è una
concomitante inibizione dell’espressione di cro da PR. Se
dall'altra parte, predomina la proteina cro, questa si lega
preferenzialmente ad OR3, ed impedisce il legame della RNA
polimerasi inibendo la sintesi del repressore. La trascrizione è
stimolata da PR ed i geni per il ciclo litico sono indotti. E'
evidente quindi che la chiave per la lotta è il livello relativo dei
prodotti dei geni di cro e cI. Ciò è determinato da fattori
ambientali. L'abbondanza di nutrienti favorisce il ciclo litico
mentre un ambiente con condizioni nutrizionali meno favorevoli
favorisce il lisogeno. Questo permette al fago essenzialmente di
mettere un fermo al sul suo ciclo vitale fino a quando
prevarranno condizioni di crescita più favorevoli. Il prodotto del
gene cII media il rilevamento delle condizioni nutrizionali. CII è
suscettibile alla degradazione da proteasi e questi enzimi sono
abbondanti in terreni ricchi di nutrienti. Bassi livelli di CII sono,
quindi, presenti in terreni ricchi di nutrienti mentre livelli più
alti sono presenti nei mezzi poveri di sostanze nutritive. CII
favorisce la lisogenia attivando il promotore PRE che a sua volta
produce il repressore di λ. CII inoltre favorisce la lisogenia in
quanto il promotore PRE genera trascritti anti-senso di cro.
18. Vedere la Figura 8.17. Danni da agenti mutageni come la
luce UV o mutageni chimici causano il rilascio della progenie
fagica di λ dal lisogeno a seguito dell’induzione del pathway del
sistema SOS. Un ruolo chiave in questo percorso lo svolge la
proteina RecA. RecA normalmente svolge un ruolo nella
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ricombinazione, ma agisce anche come co-proteasi nell’indurre
un’attività proteasica latente nel repressore di λ. Questo porta
alla scissione ed inattivazione del repressore. Non appena il
repressore è distrutto non può più indurre la propria espressione
ed i siti dell’operatore a cui si lega, OR1 e OR2, sono liberi.
Questo consente alla polimerasi di legare PR e di trascrivere
cro. Il prodotto del gene cro quindi si lega ad OR3 e stimola la
propria espressione inibendo l'espressione del repressore di λ. I
geni a valle di cro necessari per il ciclo litico anche sono
trascritti. In questo modo il fago passa da uno stato lisogenico
ad uno stato litico.
19.Vedi la Figura 8.19:
20. Fai riferimento alla figura 8.20 ed ai contenuti online 8.8.
Esperimenti di cambiamenti di amminoacidi possono essere
usati per dimostrare quali amminoacidi sono importanti nella
specificità di legame del repressore al suo operatore. In questi
esperimenti, i residui aminoacidici che studi strutturali hanno
previsto che svolgano un ruolo nel legare un determinato
operatore vincolanti sono modificate da esperimenti di
mutagenesi sito-diretta. Per utilizzare l'esempio del testo dei fagi
-simili come 434 e P22, possiamo prevedere che, se dovessimo
sostituire gli aminoacidi del repressore di P22 poremmo
ipotizzare che siano importanti, per il legame con l'operatore,
anche quelli ipotizzati per eseguire la stessa funzione nel fago
434, ed il repressore del fago ingegnerizzato P22 potrebbe
quindi ora legare l’operatore del fago 434. In altre parole, gli
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aminoacidi chiave nel legare l’operatore ad un repressore
possono conferire la stessa specificità di legame all’operatore da
parte di un repressore di un altro fago. Noi possiamo
visualizzare la variazione della specificità del legame al DNA
attraverso esperimenti di DNasi footprinting. Ci si aspetterebbe
di osservare il legame del repressore 434 alterato, agli operatori
del P22 e viceversa. Studi funzionali possono anche essere
utilizzati per determinare la specificità di legame dei repressori
ai loro operatori. Cellule di E. coli lisogene per il fago 434 (in
realtà, lisogene per un fago lambda recante la regione di
immunità del fago 434), per esempio, saranno immuni alla
superinfezione da parte di un altro fago lambda recante la
regione di immunità del fago 434, in quanto il repressore nel
lisogeno inattiverà i geni del fago entrante. Se, tuttavia,
potessimo ingegnerizzare un fago lambda con una regione di
immunità del fago 434 tale da avere gli aminoacidi nel suo
dominio di legame del repressore, fondamentali per il legame
agli operatori del fago P22, un lisogeno per questo fago
ricombinante non sarà più immune alla superinfezione da parte
del fago lambda con la regione di immunità del fago 434, ma
sarà tuttavia immune alla superinfezione da lambda recante la
regione di immunità del fago P22.
21. Il repressore di λ e Cro legano con affinità diverse le diverse
regioni degli stessi operatori. In particolare, il repressore si lega
con più alta affinità ad OR1 e con un’affinità più bassa ad OR3,
mentre Cro lega con più alta affinità OR3 e con un’affinità più
bassa OR1. Tali peculiarità sono mediate da interazioni
specifiche aminoacido-coppia di base per mediare il
riconoscimento tra l’elica ed il solco maggiore del DNA. Gli
aminoacidi critici e le coppie di basi sono differenti per Cro e
per il repressore di λ.
22. Le catene laterali della glutamina e dell’asparagina tendono
a formare legami idrogeno con il DNA.
23. Il metilene ed i gruppi metilici sugli aminoacidi tendono a
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legarsi al DNA tramite interazioni idrofobiche.
24. Un legame idrogeno nel contesto della rete di interazioni
DNA-proteina si riferisce al fenomeno per cui le proteine
possono interagire con il DNA bersaglio, non solo tramite
legami idrogeno con le coppie di basi del DNA, ma anche con
legami aggiuntivi aminoacido-aminoacido e legami aminoacidoscheletro fosfato. In molti casi, l'attrazione di un amminoacido
per un altro può facilitare indirettamente il legame al DNA
posizionando la catena laterale di un aminoacido in maniera
ottimale per l'interazione con la coppia di basi che funge da suo
bersaglio. Un legame idrogeno coinvolge quindi tre vie di
interazione tra aminoacidi, e, sia lo scheletro del DNA, e, sia
una coppia di basi. Vedere la figura 8.24 per esempi.
25. Vedere la figura 8.26b:
Aporepressore
Repressore
26. Vedere la figura 8.27.
27. Il riconoscimento dell’elica del repressore di λ si adatta
lateralmente nel solco maggiore dell’operatore, mentre il
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+ = increased
DNase sensitivity
- = decreased
DNase sensitivity
riconoscimento dell’elica del repressore del trp si inserisce quasi
ad angolo retto nella grande scanalatura del suo operatore.
28. I siti di riconoscimento delle proteine di legame sono spesso
presenti in due o più copie sulla molecola di DNA. Questo
permette alle proteine di legarsi come dimeri o come oligomeri.
Il legame di una proteina come dimero ad un duplice sito di
riconoscimento sulla molecola di DNA richiede meno energia
che il legame di due monomeri separatamente allo stesso
DNA. Il legame di un dimero al DNA ha più successo del
legame di due monomeri in quanto la seconda proteina del
dimero è automaticamente nel corretto orientamento per il
legame al secondo sito. Otterremo l'energia necessaria per
orientare la seconda proteina correttamente rispetto al suo DNA
bersaglio.
29. Fai riferimento ai contenuti online 8.10:
+=Aumento della sensibilità alla DNasi
-=Diminuzione della sensibilità alla DNasi
Più stretto, meno suscettibile
Più largo, più suscettibile
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30. Fai riferimento ai contenuti online 8.10. Il legame
cooperativo di dimeri del repressore di λ agli operatori separati
da un numero intero di giri dell’elica può essere dimostrato
mediante esperimenti di DNasi footprinting. Il principio alla
base di tali esperimenti è il seguente. Il legame cooperativo di
dimeri del repressore a due operatori, su di una stessa molecola
di DNA, è facilitato dal loop del DNA coinvolto nel legame.
Questo loop è il frutto di zone a maggiore e minore sensibilità
alla DNasi nella regione interessata. Questo è il risultato di una
compressione dello scheletro sul lato interno del loop e
dell’espansione dello scheletro sul lato esterno del loop. Su di
una autoradiografia da un esperimento di DNasi footprinting,
questo può essere visualizzato come un alternanza di bande
nella regione corrispondente al loop. Ciò è in aggiunta alle due
aree protette che corrispondono ai siti di legame del repressore.
Al contrario, un legame non cooperativo si tradurrà in due aree
protette che corrispondono ai siti di legame del repressore, come
prima, ma non vi sarà alcuna alterazione del pattern della DNasi
I nella regione interessata. Per dimostrare che il legame
cooperativo richiede un numero intero di giri che separa i due
siti di legame del repressore potremo creare molecole di DNA
contenenti I siti di legame del repressore separati a varie
distanze. Solo le distanze che sono multipli di 10,5 coppie di
basi conterranno un numero intero di giri dell’elica. Queste
molecole di DNA verranno marcate, potranno legare dimeri del
repressore ed essere sottoposte poi a trattamento con DNasi. Ci
si aspetta di osservare un pattern alternato nella regione tra i siti
di legame del repressore solo quando quei siti sono separati da
un numero intero di giri dell’elica. Tale risultato suggerisce che
i singoli dimeri di repressore sono legati cooperativamente,
facilitati dal loop del DNA. Ci aspettiamo che un numero non
intero di giri, tra i siti di legame del repressore, sarà proibitivo
per il legame cooperativo dei dimeri di repressore in quanto le
proteine non saranno allineate sulla stessa faccia del DNA dopo
il loop. Questo sarà evidente in questo esperimento per la
mancanza di un’alterazione della sensibilità alla DNasi con
un’insensibilità tra i due siti di legame del repressore.
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31. Vedere la Figura 8.30. Siamo in grado di utilizzare la
microscopia elettronica per dimostrare che I dimeri del
repressore di λ si legano cooperativamente al DNA sugli
operatori separati da un numero intero di giri dell’elica. Come
descritto nel precedente esperimento, possiamo ingegnerizzare
molecole di DNA contenenti siti di legame per l’operatore
separati da varie distanze. Solo le distanze che sono multipli di
10,5 coppie di basi (il numero di coppie di basi in un singolo
giro dell’elica) mostreranno la formazione di un loop in una
micrografia elettronica quando queste molecole possono legare
dimeri del repressore di λ.
32. σ54 è difettoso, perché, mentre l’oloenzima dell'RNA
polimerasi contenente σ54 può legarsi al suo promotore glnA,
non può dirigere la formazione di un complesso aperto del
promotore.
33. La formazione di un complesso aperto tra Eσ54 ed il suo
promotore dipende da un enhancer batterico che lega l’attivatore
NtrC, e l’ATP, che è idrolizzato da NtrC.
34. Il seguente approccio può essere utilizzato per dimostrare
che il loop del DNA è coinvolto nell'interazione tra Eσ54 al
promotore di glnA e di NtrC legata all’enhancer. Possiamo
ingegnerizzare un ceppo di E. coli in cui l’enhancer ed il
promotore sono su molecole di DNA separate legate in catene.
Un legame intracatena tra le due molecole circolari consente
l’avvicinarsi dei due elementi cis-agenti. Tuttavia, questa
struttura esclude qualsiasi scorrimento della proteina legata
all’enhancer tramite Eσ54 dal momento che si trovano su
molecole separate. Essa esclude inoltre l'attivazione della
trascrizione da parte di qualsiasi rotazione del DNA o
alterazione della struttura secondaria causata dal legame di NtrC
al sito di enhancer. Ogni attivazione della trascrizione osservata
suggerisce l'interazione delle proteine tramite il loop. Siamo in
grado di misurare l'attivazione dal promotore attraverso
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l'espressione genica, o possiamo direttamente cercare il loop
mediante microscopia elettronica. Ci si aspetta di vedere
l'attivazione del promotore di glnA e ci aspettiamo, inoltre, di
visualizzare direttamente il loop utilizzando la microscopia
elettronica. In effetti, questo è ciò che è stato osservato (Figura
9.20).
35. L’enhancer per il fago T4 σ55 è molto diverso da quello per
l’enhancer di σ54. L’enhancer per T4 non mappa in un singolo
sito; piuttosto, è la sua forcella di replicazione, e, la sua proteina
legata è una o più delle proteine dell’apparato replicativo, che si
muove lungo la forcella. Questo enhancer non contatta la sua
RNA polimerasi tramite il loop così come fa σ54, e, per
funzionare deve essere sulla stessa molecola di DNA, come il
promotore che la controlla.
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Per l’approfondimento
1.
Per verificare l'ipotesi che un particolare gene con due
diversi promotori è riconosciuto da due fattori σ
distinti, può essere usato il seguente approccio. Siamo
in grado di purificare l'attività della polimerasi da
cellule in cui questo gene è attivo. Se , per esempio, si
individuano due attività polimerasiche con la
cromatografia di DNA-cellulosa possiamo usare
queste polimerasi in un saggio di trascrizione run-off
con nucleotidi radiomarcati. Possiamo utilizzare una
polimerasi associata con un fattore σ in un saggio ed
un’altra polimerasi associata con un secondo fattore σ
in un secondo saggio. Come stampo si può utilizzare
un frammento del gene tronco e se osserviamo
trascritti di run-off di due dimensioni differenti,
prodotte da due diversi fattori σ, confermiamo
l'ipotesi che il gene contiene due promotori.
2. Una cellula di E. coli che è lisogena per un particolare fago λ
è immune da superinfezione da un ceppo di λ identico. Questo è
perché il profago produce il repressore di λ (CI) e questo
spegnerà la repressione di tutti i geni fagici, ad eccezione dei
geni che codificano per il repressore stesso. Le molecole di
repressore che si trovano in E. coli a seguito dell’infezione con
il secondo fago λ, inattiveranno tutti I geni del fago che vuole
entrare rendendo così impossibile la superinfezione da parte del
lisogeno.
3.
Trasfettando cellule di E. coli lisogenizzate con un
particolare fago λ ,lisogenizzato con un secondo fago λ,
avente le sequenze dell’operatore significativamente
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diverse da quelle del lisogeno, ci aspetteremo di
ottenere una superinfezione. Questo è dovuto al fatto
che il repressore di λ prodotto dal lisogeno non
riconosce gli operatori del secondo fago, con
conseguente abolizione della repressione, consentendo
l'espressione genica del secondo fago, e quindi
l’infezione.
4. Irradiando i λ lisogeni di E. coli geneticamente diversi, uno
che diventa un ceppo litico ed uno che rimane lisogenico, si
potrebbe spiegare questo fenomeno ipotizzando che il ceppo
non-litico abbia una mutazione nel gene RecA. Una mutazione
di questo tipo impedirebbe una distruzione RecA-indotta del
repressore di λ, il che significa che E. coli non sarebbe stata
liberata dai lisogeni.
5. In un ceppo di λ mutato nel gene CII , l’infezione litica si
verificherà il 100% delle volte. CII è necessario per attivare
l'espressione da PRE, il promotore per il mantenimento del
repressore. In sua assenza nessun repressore di λ è sintetizzato
per indurre lisogenia. Inoltre, CII induce l'espressione dei geni Q
e cro i cui prodotti sono necessari per la trascrizione dei geni
tardivi necessari per il ciclo litico. In alternativa, il fago
potrebbe portare una mutazione nel gene cI, che codifica per il
repressore. Senza il repressore, non ci può essere infezione
lisogenica.
6. In un ceppo di λ che produce sempre lisogeni è probabile che
sia mutato il gene cro. La proteina cro inibisce la trascrizione
del gene cI che codifica per il repressore di λ mentre allo stesso
tempo induce la trascrizione del suo stesso gene e dei geni
necessari per il ciclo litico.
7. Un ceppo di λ con un gene N inattivato non produrrà né
infezione litica né lisogenica. Questo è dovuto al fatto che N
funziona come un antiterminatore per consentire l'espressione
dei geni precoci ritardati. I prodotti dei geni precoci ritardati
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sono necessari per il mantenimento sia del ciclo litico che del
ciclo lisogenico.
8. La seconda frase in questa domanda deve essere nuovamente
formulata per dire: "Modificando questa asparagina (non
glutamina) in alanina ..." Residui di asparagina tendono a
formare legami idrogeno con il DNA. Il cambiamento di questa
asparagina in alanina blocca l'interazione proteina-DNA in
quanto l’alanina tende ad interagire con il DNA attraverso
interazioni idrofobiche. La citosina è priva di ogni gruppo
idrofobico metilico o metilenico. Possiamo tuttavia ripristinare
il legame al mutante mediante una mutazione compensativa nel
DNA bersaglio, cambiando la citosina bersaglio in timina. Ciò è
dovuto al fatto che la timina, attraverso il suo gruppo metilico,
può formare una interazione idrofobica con l’alanina e che
questa interazione ripristina i contatti l'aminoacido-coppia di
basi del DNA in questa posizione.
9. Si potrebbe verificare questa ipotesi utilizzando un
esperimento di mutagenesi sito-diretta, per modificare le
coppie di basi che sembrano svolgere un ruolo nel legare
la proteina tramite svolgimenti ed avvolgimenti del solco
più stretto. I siti bersaglio del DNA 4, 5 e 6 possono essere
modificati per includere coppie di basi (coppie G-C) che
sono meno sensibili allo svolgimento. Se questa
alterazione risultasse nella diminuzione della capacità di
legame della proteina bersaglio alla sua sequenza
bersaglio, questo sarebbe a favore dell’ipotesi presentata.
10.Per una coppia di basi T-A, bisogna richiamare
l'immagine speculare della coppia di A-T illustrata in
Figura 2.13. Nel diagramma seguente, le A rappresentano
il sito accettore per I legami idrogeno mentre le D
rappresentano siti donatori per i legami idrogeno.
Rilevante per l’interazioni con la proteina con queste
coppie di basi è la constatazione che all'interno del solco
maggiore il profilo dei legami idrogeno è ben diverso,
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ancor di più che nel solco minore. Pertanto, le proteine
utilizzano il solco maggiore per discernere una particolare
coppia di basi. Questo pattern distinto nel solco maggiore
di una coppia di basi A-T è facilmente individuabile dal
profilo di legami idrogeno accettori e donatori presenti nel
solco maggiore di una coppia di basi G-C.
Solco maggiore
Solco minore
