LABORATORIO BIOLOGIA MOLECOLARE
2° ANNO-1° SEMESTRE
C.d.L. BIOTECNOLOGIE
AA. 2010/2011
2° LEZIONE: ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSO
Attrezzatura richiesta:
Apparato per elettroforesi orizzontale,
o Power supply,
Forno a microonde,
Transilluminatore a raggi UV
Reagenti:
Agarosio,
o TAE 1X,
loading buffer 6X
L’elettroforesi su gel di agaroso e’ un metodo semplice e veloce che permette di separare, e
quindi identificare, frammenti di DNA in base al loro peso molecolare.
Il gel può essere costituito da agaroso o da poliacrilamide.
I gel di poliacrilamide sono usati per separare frammenti di DNA < 500 bp e hanno
un’elevata risoluzione, ma sono più complicati e pericolosi da preparare e più difficili da
maneggiare rispetto ai gel di agaroso.
I gel di agaroso sono semplici da preparare e sono tipicamente usati per separare
frammenti di dimensioni variabili da poche centinaia di basi a 20 kb. Essi sono
largamente utilizzati per la maggior parte delle analisi rutinarie su DNA. L’agaroso è un
polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma una
matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’ agaroso.
I frammenti migrano, nel campo elettrico che attraversa il gel, dal polo negativo a quello
positivo, in funzione delle cariche elettriche conferitegli dai gruppi fosfato.
La velocità di migrazione dipende:
1) dalle dimensioni dei frammenti,
o 2) dalla percentuale dell’agaroso nel gel,
3) dal voltaggio applicato.
La matrice porosa del gel ritarda la migrazione del DNA, consentendo ai piccoli frammenti di
spostarsi più velocemente rispetto ai più grandi. Il risultato è che i frammenti di DNA si
separeranno nella matrice in funzione del peso molecolare e, a parità di peso molecolare, il
DNA circolare migrerà più velocemente di un DNA lineare, in quanto assume una
conformazione detta super avvolta (super coiled DNA).
Più elevate concentrazioni d’agaroso si usano per separare le molecole più piccole e,
viceversa, concentrazioni più basse sono più adatte a separare frammenti più grandi.
Il tampone di elettroforesi è una soluzione salina che serve sia a condurre la corrente elettrica
che a controllare il pH durante l’elettroforesi.
La concentrazione dell’agaroso può essere variata per ottimizzare la migrazione, se si ha
un’idea della grandezza dei frammenti di DNA da migrare.
I gel di uso più comune sono allo 0,8-1%. Questa concentrazione riesce a separare un range
di dimensioni da circa 500 bp a circa 20.000 bp. (Separazione significa differenziare tra 2 o
più frammenti di differenti dimensioni).
Se si usa meno agaroso, es. 0,5%, la migrazione dei frammenti <2.000 bp non sarà
abbastanza “ostacolata” dalla matrice e, quindi, questi migreranno alla stessa velocità senza
nessuna separazione.
Viceversa, se si usa più agaroso, es. 2%, si osserverà una migliore separazione dei piccoli
frammenti, perché anche questi saranno rallentati dalla matrice più concentrata. Tuttavia, a
questa concentrazione qualsiasi frammento >3-4.000 bp non si muoverà più in modo
efficiente e non si avrà nessuna separazione.
Per sciogliere l’agaroso, piuttosto che usare l’acqua distillata, si usano soluzioni tamponate
che consentono al DNA di muoversi uniformemente lungo il gel. Queste soluzioni hanno lo
scopo, infatti, di determinare e mantenere stabili il pH e la concentrazione di ioni del gel.
TAE e TBE sono i tamponi più comunemente usati per l’elettroforesi. T sta per Tris, che
consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione; E sta per EDTA, che
chela i cationi divalenti, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle
nucleasi richiede cationi divalenti per funzionare. A o B sta per acido Borico o Acetico che
forniscono l’appropriata forza ionica al tampone.
Dopo aver pesato l’agaroso e misurato il tampone, i due vengono mescolati. Dal momento
che l’agaroso non è solubile a temperatura ambiente, esso deve essere portato ad ebollizione
utilizzando il forno a microonde, l’autoclave o un agitatore magnetico.
Il sistema di costruzione di un gel di agaroso è costituito da tre parti, la piastra, il supporto
(slitta) e il pettine. Quest’ultimo serve a realizzare i pozzetti: si immerge nel gel “a denti in
giù”, quando è caldo e liquido e poi, quando l’agaroso si sarà solidificato, si estrae, lasciando
vuoti gli spazi precedentemente occupati dai denti.
A temperatura ambiente, il gel polimerizzerà in 10 - 15 minuti.
Il gel viene quindi sistemato nella camera di elettroforesi e sommerso completamente con il
tampone di elettroforesi, in modo che l’intero gel sia soggetto ad uguale corrente elettrica.
Il campione di DNA, di qualsiasi tipo (estratto, restrizione enzimatica, etc.) è in soluzione
acquosa. Questa, essendo di densità pari a quella del tampone, non riuscirebbe ad impedire
che il campione “scappi” dal pozzetto. Si aggiunge quindi per “appesantire” i campioni il
tampone di caricamento (colorante + addensante: glicerolo, saccarosio, Ficoll), che permette
la loro permanenza nei pozzetti, e fornisce un marker visivo della progressione della corsa
elettroforetica. Infatti, sono presenti delle molecole caricate dette “coloranti”, di differenti colori
e dimensioni. Uno, il blu di bromofenolo, è più piccolo di quasi tutti i frammenti di DNA e,
quindi, migrerà con i frammenti piccoli. L’altro, lo xilene cianolo, è una molecola grande, che
migra insieme ai frammenti di più elevato peso molecolare. Si può perciò presumere che la
maggior parte dei campioni migrerà nella zona interposta tra i due coloranti, cosicché quando
il blu di bromofenolo sarà giunto in prossimità del fondo del gel, si potrà interrompere la corsa.
Tipicamente 5 - 20 ul sono caricati in ogni pozzetto, immergendo il puntale nel tampone di
elettroforesi, fino ad avvicinarsi all’ingresso del pozzetto.
A questo punto si collega l’apparecchio ad un alimentatore e si applica il campo elettrico.
Dopo aver rimosso il gel dall’apparecchio di elettroforesi, si può visualizzare il DNA mediante
colorazione con bromuro di etidio, una molecola che emette fluorescenza una volta esposta
agli UV. Il bromuro di etidio è un agente che si intercala tra le basi del DNA e quando è legato
al DNA ha uno spettro di eccitazione della fluorescenza con un massimo a 302 nm e presenta
una fluorescenza circa 10 volte maggiore rispetto alla molecola del bromuro di etidio libero.
Il gel viene posto su un transilluminatore a luce UV e viene osservato.
Obbligatorio l’uso di:
* Guanti
* Schermo protettivo
Perché?
1) protezione del DNA dalle nucleasi
2) il bromuro di etidio è un potente mutageno
3) gli UV danneggiano gli occhi
Sebbene la mobilità elettroforetica del DNA in presenza di
bromuro di etidio si riduca di circa il 15%, la possibilità di
esaminare il gel direttamente agli UV durante la migrazione
può essere molto utile. Inoltre, la risoluzione è nettamente
migliore, in caso di frammenti di DNA di basso peso
molecolare. Nel caso, invece, di colorazione del gel dopo la
migrazione, il gel è immerso per 30-45 minuti nella soluzione
colorante e osservato agli UV. Una decolorazione non è il più delle volte necessaria, ma
l’identificazione di piccole quantità di DNA è più facile, se il background causato dal bromuro
di etidio non legato viene ridotto immergendo il gel in acqua distillata per 20 minuti a
temperatura ambiente. Dopo l’uso, le soluzioni di bromuro di etidio dovrebbero essere
“decontaminate”, attraverso trattamenti chimici che ne riducano l’attività mutagena.
Il bromuro di etidio si decompone a 262°C.
Concetto di banda
Una banda rappresenta un area occupata da una popolazione di molecole distinguibili da un
altra area. Una banda può comprendere una sola specie molecolare (ad esempio l’rRNA 28S)
oppure più specie molecolari che si comportino omogeneamente rispetto alla migrazione.
Viceversa, una stessa specie molecolare può assumere conformazioni alternative con
comportamenti migratori diversi, che ne determinano la ripartizione in bande distinte. Il potere
di risoluzione di un gel è la capacità di separare specie molecolari differenti ed è tanto
maggiore quanto minore è la differenza tra le molecole separate efficacemente.
DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE
Il metodo più accurato per valutare se la banda visualizzata sul gel è effettivamente quella
desiderata è la relazione matematica che collega la velocità di migrazione alle dimensioni. La
formula è la seguente:
D= a - b(logM)
in cui D è la distanza percorsa
M è la massa molecolare
a e b sono costanti che dipendono dalle condizioni di elettroforesi.
Poiché non sempre è necessaria un’estrema accuratezza nella stima delle dimensioni dei
frammenti, in genere si usa un metodo molto più semplice: si fa migrare insieme ai nostri
campioni un digerito di restrizione standard che contiene una miscela di DNA di grandezza
nota detto marcatore di dimensione (ad esempio, i digeriti del DNA λ). Potremmo quindi
valutare la grandezza del frammento amplificato tramite una stima approssimativa ad occhio
o attraverso una più accurata ottenuta per estrapolazione dalla curva, ottenuta, mettendo le
dimensioni dei frammenti nell’asse Y e la distanza di migrazione in cm nell’asse X.
Due esempi di marcatori
LAMBDA DNA
100pb PLUS
LAMBDA DNA HindIII
MARKER 2
PREPARARE UN GEL D’AGAROSO AL 1% (100ml)
Preparare Tampone TAE1X dalla madre 50X: Diluire 50 volte in acqua deionizzata: 20 ml in
1L di acqua
Pesare 1gr d’agaroso
Scioglierlo in 100ml di tampone TAE1X
Scaldarlo al forno a microonde per 2-3 minuti, se possibile evitare di farlo bollire.
Aggiungere 5 µl di Etidio Bromuro, agitare FACENDO MOLTA ATTENZIONE
(L’etidio bromuro è altamente cancerogeno e mutageno!!)
Versarlo nella slitta che avremo precedentemente pulito con acqua deionizzata e in cui
avremo inserito il pettine. E’ importante evitare di fare bolle.
Lasciare raffreddare fino a completa solidificazione del gel.
