Penicillin-Binding-Proteins - Università di Catanzaro Facoltà di

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “MAGNA GRÆCIA“ DI CATANZARO
FACOLTÀ DI FARMACIA
Scuola di Specializzazione in Farmacia Ospedaliera
TESINA DI CHIMICA FARMACEUTICA 1
Penicillin-Binding-Proteins
Miriam Ciriaco
Matr. 90589
ANNO ACCADEMICO 2005-2006
INDICE
CAPITOLO 1:
1.1. Introduzione
pag. 3
1.2. Differenze nella parete batterica di Gram + e Gram -
pag. 5
1.3. Sintesi di peptidoglicano
pag. 6
CAPITOLO 2:
2.1. PBPs
pag. 10
2.2. Alcuni studi
pag. 11
CAPITOLO 3:
3.1. Penicilline
pag. 14
3.2. Meccanismo d’azione
pag. 15
3.3. Uno studio
pag. 16
3.4. Spettro d’azione delle penicilline
pag. 17
CAPITOLO 4:
4.1. Resistenza batterica
pag. 19
4.2. Studi conformazionali
pag. 20
4.3. Inibitori delle beta lattamasi
pag. 22
CAPITOLO 5:
5.1. Infezioni nosocomiali per antibiotico resistenza
pag. 25
CAPITOLO 6:
6.1. Conclusioni
pag. 26
CAPITOLO 7:
Bibliografia e Webgrafia
pag. 27
2
CAPITOLO 1
1.1. Introduzione
Un chemioterapico ideale è, riprendendo il concetto espresso da Paul Ehrlich padre della
moderna chemioterapia, una sorta di “magico proiettile”, capace di distruggere l’agente invasivo
senza ledere l’ospite. Questo concetto di tossicità selettiva si adatta bene agli antibiotici betalattamici [1].
Gli agenti chemioterapici diretti contro qualsiasi stadio della sintesi, del trasporto,
dell’assemblaggio e della formazione dei ponti trasversali del peptidoglicano provocano
un’inibizione della crescita batterica e, nella maggior parte dei casi, la morte cellulare.
Gli antibiotici β lattamici (penicilline, cefalosporine, carbapenemi e monobattami), caratterizzati
dalla presenza di un anello β lattamico a quattro atomi, impediscono la formazione dei legami
crociati dello scheletro glicolipidico (transpeptidazione).
La transpeptidasi ed altri enzimi simili coinvolti in questa reazione vengono chiamati proteine
leganti la penicillina (penicillin-binding-proteins, PBP) poiché contengono siti attivi in grado di
legare gli antibiotici beta lattamici [2].
La parete protegge i batteri dalla rottura cellulare legata alla differenza di osmolarità tra l’interno
della cellula, fortemente iperosmolare (fino a 20 atm) e i tessuti dell’ospite, generalmente
isosmolari o iposmolari. La struttura che conferisce alla parete rigidità e resistenza alla lisi
osmotica è il peptidoglicano, che forma attorno al batterio un involucro contenente legami
covalenti.
Il peptidoglicano è composto da uno scheletro di due aminozuccheri che si alternano: Nacetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM) uniti, mediante legame β1→
glucosidico, ad una catena di quattro aminoacidi, inoltre, un peptide a ponte collega le catene
peptidiche (Fig. 1).
3
Figura 1: Peptidoglicano
Le subunità che aggregate formano il peptidoglicano (uno zucchero legato a cinque aminoacidi)
vengono assemblate nel citoplasma e poi trasportate, attraverso la membrana citoplasmatica,
verso la superficie cellulare. Il successivo legame tra le subunità si realizza attraverso il clivaggio
dell’aminoacido terminale del ramo peptidico (Fig. 2).
Disaccaride+ peptide
Ponti di pentaglicina
Figura 2: Legami tra le diverse catene
4
1.2. Differenze nella parete batterica
Tramite la colorazione di Gram è stato possibile distinguere le due tipologie batteriche in
funzione delle differenze di composizione proprio della membrana esterna: nei batteri Gram
positivi il peptidoglicano è l’unico strato esterno alla membrana cellulare e il suo spessore va dai
20 agli 80 nm, inoltre sono presenti proteine ed acidi tecoici (glicerina e ribitolo alternati con
acido fosforico); nei batteri Gram negativi è presente una membrana esterna di lipopolisaccaride
(LPS) che ricopre uno strato molto sottile (1 nm) di peptidoglicano [3] (Fig. 3).
Tipo di batteri
Gram (+)
Gram (-)
Peptidoglicano
Peptidoglicano
Acidi tecoici
Lipopolisaccaride
Composizione
Aspetto dei
batteri al
microscopio
ottico
Aspetto della
parete
cellulare al
microscopio
elettronico
Figura 3: Caratteristiche differenti nella parete batterica
5
Nei Gram negativi, tra le membrane esterna e quella citoplasmatica, si trova lo spazio
periplasmico che è sede sia della parete del peptidoglicano sia degli enzimi β- lattamasici, come
penicillasi e cefalosporinasi, capaci di idrolizzare l’anello beta lattamico degli antibiotici.
L’organizzazione strutturale dei Gram negativi rende difficile l’attacco da parte degli antibiotici
beta lattamici poiché questi devono diffondere attraverso porine presenti sulla membrana esterna
per poter raggiungere le maglie di peptidoglicano e, quindi, la membrana citoplasmatica ove si
trovano i siti bersaglio: serinoproteasi, transpeptidasi, transglicolasi ecc., enzimi necessari alla
sintesi della parete batterica e proteine leganti le penicilline, le PBPs; qui le beta lattamine
devono avere la capacità di resistere alle beta lattamasi costitutive dei Gram negativi per poter
esplicare la loro azione.
1.3. Sintesi di peptidoglicano
Nella sintesi di peptidoglicano si distinguono tre stadi:
1) il ciclo dell’UDP avvia il processo biosintetico portando alla produzione, nel citoplasma, di
UDP-acetilglucosamina e UDP- muramil- pentapeptide.;
2) il ciclo del fosfolipide permette di ottenere l’unione ripetuta delle due unità base in modo da
formare un polimero lineare;
3) completa lo sviluppo di parete batterica il cross-linking fra le catene neoformate (Fig. 4).
La formazione di ponti crociati, legami trasversali, si ha mediante un legame peptidico tra il
carbossile dell’alanina in posizione 4 di uno dei pentapeptidi ed il gruppo amminico libero della
lisina in posizione 3 di un’altra catena pantapeptidica con perdita di una D- alanina terminale.
L’energia per il legame di un ponte peptidico da un ramo di una subunità ad un’ altra deriva dal
clivaggio di un residuo terminale di D-alanina dal ramo peptidico stesso. L’aminoacido a ponte
viene legato alla penultima D- alanina dall’enzima transpeptidasi.
6
Figura 4: Fase di cross-linking
McDonough e coll. [4] hanno ottenuto le prime strutture cristallografiche di intermedi cinetici
coinvolgendo una PBP, la D-alanil-D-alanina carbossipeptidasi/transpeptidasi del batterio
Streptomyces R61 ed un suo substrato specifico, un tetrapeptide che corrisponde ad una porzione
di peptidoglicano. È stato estrapolato il complesso enzima-substrato unito non covalentemente
(ES) e poi il complesso enzima-prodotti (EPs) (Fig. 5).
Nella figura E è l’enzima libero, S è il substrato, ES è il complesso non covalente, ES* è il
complesso covalente, EP è il complesso non covalente tra l’enzima e il peptide idrolizzato, e P
rappresenta il peptide libero prodotto.
Figura 5: Reazione carbossipeptidasica di R61 DD-peptidasi
7
Nel complesso ES (Fig. 6A)
si può vedere l’ossigeno catalitico della Serina attiva S62
posizionato a 2.8 A° dal carbonio del carbonile del peptide legato. Numerose interazioni non
covalenti, tra il tetrapeptide substrato e l’enzima, dimostrano la straordinaria specificità di tale
substrato.
Figura 6A. Complesso ES. I residui del sito attivo sono in giallo, il tetrapeptide substrato è
arancione. I legami idrogeno sono raffigurati come linee tratteggiate grigie, le interazioni
idrofobiche gialle, e i cross-links come linee piene rosse.
Figura 6B. Il complesso EPs. Sia il tripeptide prodotto sia la D-alanina libera sono in
arancione.
8
Nel complesso EPs (Fig. 6B) si osservano cambiamenti conformazionali sia nel tripeptide
prodotto sia nei residui del sito attivo che provocano l’espulsione finale dei prodotti.
La D-alanina terminale ruota di 110 gradi rispetto al legame del carbonio alfa, disponendo il
gruppo carbonilico in una situazione di relativa idrofobicità, mentre il metile si muove sul piano
di un legame idrogeno che conserva un residuo di asparagina, terminando la reazione. Inoltre, la
catena di treonina 301 si trova in una conformazione molto tesa.
9
CAPITOLO 2
2.1. PBPs
Le Penicillin- Binding- Proteins sono enzimi con ruoli diversi ed essenziali all’interno della
cellula batterica e la cui mancanza o inibizione ha effetto battericida.
Le PBP – 1 sono transpeptidasi, come le serinotransferasi, necessarie all’integrità strutturale e la
cui inibizione porta all’estensione della parete e alla lisi cellulare;
le PBP – 2 sono endopeptidasi preposte al mantenimento della forma bacillare di alcuni batteri e
la loro inibizione genera forme ovali;
le PBP – 3 sono transpeptidasi del setto la cui inibizione produce batteri filamentosi, privi di
setto;
Le PBP- 4, - 5, -6, hanno ruoli la cui inibizione non conduce a morte batterica.
Nell’ultimo decennio, sono stati condotti molti studi di tipo biochimico e chimicoconformazionale per sapere di più su tali enzimi, per indagarne le funzioni e per scoprirne gli
effetti in seguito a mutazioni (come sostituzioni aminoacidiche o delezioni), al fine di
individuare target per lo sviluppo di nuovi farmaci antimicrobici che subentrino a quelli verso
cui i batteri hanno ormai rivolto meccanismi di resistenza.
L’approccio di Drug Design Razionale, diretto o Receptor-based, è tra quelli fondamentali e
maggiormente riusciti per le caratteristiche di razionalità nella ricerca e sviluppo, appunto, di
molecole interagenti con un substrato la cui struttura ai raggi X è nota.
10
2.2. Alcuni studi
Strutture tridimensionali di numerosi peptidi coinvolti in diversi processi cellulari sono state
determinate attraverso tecniche spettroscopiche, NMR e raggi X. Tali strutture sono state
catalogate e rese disponibili via web in una sorta di “banca dati” mediante la quale è possibile
risalire alla molecola d’interesse, trovarne i riferimenti in letteratura e tracciarne le caratteristiche
come la sequenza aminoacidica in dettaglio, la misura degli angoli di legame ecc.
Inserendo “Penicillin-Binding-Proteins” per la ricerca su Protein Data Bank, le immagini
cristallografiche fornite sono 128. I modelli riportati presentano diversi valori di risoluzione,
mostrano strutture di peptidi non legati ad alcun substrato e strutture cocristallizzate nelle quali è
possibile riconoscere i siti di legame ed i gruppi funzionali interagenti e più interessanti da un
punto di vista di studio conformazionale.
Tra i numerosi studi effettuati negli ultimi anni quello di Nicholas e collaboratori [5] svela gli
effetti di una mutazione indotta nella PBP-5.
La funzione della PBP-5 nell’Escherichia coli è D-alanina -carbossipeptidasica (CPase): scinde
la D-alanina dall’estremità C-terminale dalla catena peptidoglicanica. Come tutte le PBPs, la
PBP-5 forma un complesso acil-enzima con gli antibiotici beta lattamici, ma si distingue per
l’elevato rapporto di deacilazione del complesso ( t 1/2 10 minuti circa).
Secondo questo studio una mutazione consistente in Gly105→Asp migliora sensibilmente la
deacilazione con minimi effetti sull’acilazione, inoltre abolisce l’attività carbossipeptidasica.
La struttura tridimensionale della forma solubile della PBP-5 originaria (non mutata) è stata
determinata con una risoluzione di 1.8 A° (Fig. 7) e quella della forma mutata Gly105 con un
valore di risoluzione di 1.9 A°.
Il confronto delle due strutture rivela che l’effetto principale della mutazione è un disordine nel
tratto che comprende i residui 74-90 che si trovano a livello del sito attivo. Questi dati
suggeriscono un ruolo diretto nella deacilazione e nella regolazione del complesso acil-enzima
per il tratto 74-90.
11
Figura 7. 1NZO: PBP5 nativa [5]
Il recentissimo studio condotto da Kishida [6] mostra la struttura cristallina della PBP-4 derivata
da Escherichia coli. Questa possiede attività sia di DD-endopeptidasi, sia di DDcarbossipeptidasi. La PBP-4 è una delle 12 PBPs presenti nell’Escherichia coli che sono
coinvolte nella sintesi e nel mantenimento della parete cellulare.
Il modello proposto contiene un dominio legante le penicilline che include una vasta inserzione
con ripiegamenti nei domini(Fig. 8-9). Le strutture della proteina possono legare covalentemente
fino a cinque diversi antibiotici con i residui dei siti attivi che restano immodificati nella
disposizione delle α-eliche e nella superficie. La geometria dei residui del sito attivo confrontata
con altre PBPs suggerisce una possibile causa della lenta acilazione delle PBP-4.
12
Figura 8. 2EX6: PBP-4 e ampicillina [6]
Figura 9. 2EX8: PBP-4 e penicillina G [6]
13
CAPITOLO 3
3.1. Penicilline
Le penicilline sono composti caratterizzati da un nucleo tiazolidinico o beta lattamico ed è
questo che rappresenta il requisito per l’attività battericida ed è quindi gruppo farmacoforo. Tale
requisito è condizionato, però, dalla presenza in posizione alfa dell’anello di un gruppo
amminico sostituito da un radicale acilico (Fig. 10).
Le penicilline sono N- acilderivati dell’acido 6- aminopenicillanico (6- APA), composto
biciclico ottenuto per fusione di un anello a quattro termini beta lattamico con un anello
tiazolidinico a cinque termini.
Si distinguono penicilline naturali, ottenute da colture di Penicillium notatum o chrysogenum, e
semisintetiche, ottenute dall’acilazione del 6- APA.
Figura 10.Classificazione delle penicilline
14
3.2. Meccanismo d’azione
Le beta lattamine si comportano da “substrati suicidi” in quanto acilano irreversibilmente gli
enzimi bersaglio all’altezza dei siti attivi, rendendoli inattivi, e contemporaneamente perdono
l’integrità della propria struttura beta lattamica.
La transpeptidasi viene acilata dalla penicillina sull’ossidrile del residuo di Serina con
conseguente formazione di penicilloil-enzima inattivo e relativa scissione del legame –CO-NHdell’anello β-lattamico.
Figura 11. Acilazione
L’anello β-lattamico dell’antibiotico forma con l’enzima transpeptidasi un legame acilico
covalente ed irreversibile probabilmente per l’analogia sterica tra l’antibiotico ed il bersaglio
dell’enzima, costituito dalle due D-alanine. A livello molecolare il meccanismo delle penicilline
consiste in un attacco nucleofilo del gruppo ossidrilico della Serina presente nell’enzima
transpeptidasi al carbonio del carbonile dell’anello betalattamico (Fig. 11).
15
3.3. Uno studio
La struttura co-cristallizzata del complesso PBP-penicillina G è stata determinata con una
risoluzione di 1.3 A° (Fig. 12) per studiarne gli aspetti del substrato specifico ed il meccanismo
catalitico. Per l’analisi è stata generata una proteina inattiva, usata per produrre complessi
enzima-substrato, provocando la mutazione di un residuo implicato nella stabilizzazione
dell’intermedio tetraedrico che si forma durante la catalisi così da inattivare l’enzima senza
prevenire il processo autocatalico o l’abilità di legare il substrato.
Il residuo dell’enzima mutato in Ala sull’-OH è Asn B241 ed ha un ruolo importante nel
mantenere la geometria del sito attivo e nel legare del substrato, Le analisi di questa struttura
mostrano una reazione che procede in maniera diretta attraverso un attacco nucleofilo della Ser
B1 sull’amide [7].
Figura 12. 1GM7: PBP-penicillina G [7]
16
3.4. Spettro d’azione delle penicilline.
Tutte le penicilline (ad eccezione degli agenti antistafilococcici semisintetici penicillasiresistenti) vengono idrolizzate dalle beta lattamasi e sono quindi inefficaci contro ceppi che
producono questi enzimi. La penicillina G ha uno spettro che comprende le spirochete
(Treponema pallidum, Borrelia e Leptospira), gli streptococchi (di gruppo A e B, viridanti e
Streptococcus pneumoniae), gli enterococchi, la maggior parte delle neisserie e pochi
stafilococchi, molti batteri del cavo orale di difficile coltura (Porphyromonas e Prevotella spp.,
streptococchi, Actinomices e Fusobacterium), Clostridium spp. (eccetto C. difficile). Tuttavia la
resistenza alla penicillina G è molto diffusa tra gli stafilococchi, sta aumentando tra i
gonococchi, gli enterococchi, i pneumococchi e sta emergendo tra i meningococchi. La
penicillina G è un farmaco di scelta per la sifilide, la framboesia, la leptospirosi, le infezioni da
stafilococchi di gruppo A e B, l’actinomicosi, le infezioni orali e periodontali, la meningite
meningococcica, l’endocardite da streptococco viridante, il tetano, il carbonchio, la febbre da
morso di ratto.
Lo spettro dell’ampicillina si estende ad alcuni batteri Gram negativi; è attiva contro alcuni
ceppi di Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella, Shigella, H. influenzae ed è uno dei
farmaci di scelta per i microrganismi sensibili ai beta lattamici che causano infezioni urinarie,
per la salmonellosi, la meningite e la laringite da H. influenzae e per la meningite da Listeria
monocytogenes. Il frequente sviluppo di una resistenza a questo antibiotico ne ha ridotto il
valore terapeutico in alcune situazioni. Per esempio più dell’80% dei ceppi di E. coli e P.
mirabilis risulta resistente in alcuni ospedali, così come dal 10 al 30% dei ceppi di H. influenzae.
Le penicilline penicillasi-resistenti vengono usate solamente per il trattamento delle infezioni
stafilococciche e sono farmaci di scelta nelle infezioni sistemiche o profonde da germi sensibili.
Sfortunatamente, in media circa il 30% dei ceppi di S.aureus e più del 60% degli isolati di
stafilococchi coagulasi negativi acquisiti negli ospedali statunitensi sono resistenti a questi
agenti (cioè meticillino-resistenti). Lo spettro antibatterico di questi farmaci comprende anche la
maggior parte dei batteri Gram positivi sensibili alla penicillina G.
Lo spettro delle penicilline anti-Pseudomonas comprende i batteri sensibili all’ampicillina e
altri bacilli Gram negativi enterici diversi da Pseudomonas. Per esempio, la piperacillina è attiva
contro molti Proteus indolo positivi, Enterobacter, Providencia, Klebsiella e Serratia spp.
Tuttavia, la sensibilità di queste penicilline alle beta lattamasi limita notevolmente la loro utilità
come terapia empirica di fronte al sospetto di infezioni causate da microrganismi Gram negativi
enterici. Il ruolo principale di questi composti è nel trattamento di infezioni, dimostrate o
17
sospette, da P.aeruginosa e Acinetobacter, per i quali sono tra i farmaci di scelta. La loro attività
relativa nei confronti di Pseudomonas è la seguente: piperacillina>mezlocillina>carbenicillina
[8-9].
PENICILLINE SENSIBILI ALLE BETA LATTAMASI
SPETTRO LIMITATO
Penicillina G
Penicillina V
ATTIVE SUI BACILLI ENTERICI
Ampicillina
Amoxicillina
Carbenicillina, ticarcillina,
ATTIVE SUI BACILLI ENTERICI E
mazlocillina, azlocillina,
PSEUDOMONAS
piperacillina, Indanilcarbenicillina
PENICILLINE RESISTENTI ALLE BETA LATTAMASI
Meticillina, oxacillina,
ANTISTAFILOCOCCIHCE
nafcillina,
Cloxacillina, dicloxacillina
Ticarcillina e acido
clavulanico,
ASSOCIAZIONI CON INIBITORI
ampicillina e sulbactam,
DELLE BETA LATTAMASI
piperacillina e tazobactam
Amoxicillina e acido
clavulanico
18
CAPITOLO 4
4.1. Resistenza batterica
Batteri che sono normalmente suscettibili a certi agenti antibatterici possono acquisire resistenza.
La resistenza acquisita rappresenta una della principali limitazioni a un’efficace chemioterapia
antibatterica.
I batteri sviluppano resistenza agli antibiotici beta lattamici con vari meccanismi. Il più comune è
la distruzione del farmaco da parte di beta lattamasi. Le beta lattamasi dei Gram negativi sono
confinate nel periplasma, tra la membrana più interna ed esterna; i batteri Gram positivi liberano
le loro beta lattamasi nello spazio circostante. Questi enzimi hanno un’affinità maggiore per il
farmaco di quanta non ne abbia quest’ultimo per il suo bersaglio. Il legame comporta l’idrolisi
dell’anello beta lattamico. Geni che codificano per beta lattamasi sono stati identificati sia in
sede cromosomica che extracromosomica e sia nei batteri Gram positivi che in quelli Gram
negativi; questi geni si trovano spesso in elementi genetici mobili (plasmidi, trasposoni e
batteriofagi). Per superare la resistenza mediata dalle beta lattamasi è stata attuata una strategia
che consiste nel somministrare il beta lattamico in associazione con un inibitore enzimatico che
si lega avidamente all’enzima inattivante prevenendo il suo attacco all’antibiotico.
Sfortunatamente questi inibitori (per esempio acido clavulanico, sulbactam, tazobactam) non
legano tutte le classi di beta lattamasi e quindi non si ha la certezza che possano sempre
prevenire l’inattivazione di un antibiotico beta lattamico.
Non sono disponibili allo stato attuale antibiotici beta lattamici o inibitori che possano resistere a
tutte le beta lattamasi che sono state identificate.
Un secondo meccanismo di resistenza batterica ai beta lattamici è un’alterazione delle strutture
bersaglio PBP (penicillin-binding-proteins), in modo tale che esse abbiano un’affinità
marcatamente ridotta per il farmaco. Anche se questa alterazione può avvenire per mutazione di
un gene già esistente, è molto più importante l’acquisizione di nuovi geni PBP (come nella
resistenza alla meticillina degli stafilococchi) o di nuovi segmenti dei geni PBP (come nella
resistenza alla penicillina di streptococchi, gonococchi e meningococchi) [2].
19
4.2. Studi conformazionali
È stata descritta la struttura della PBP 2x estratta da Streptococcus pneumonie e determinata con
una risoluzione di 2.4 A° (Fig. 13); la struttura mette in luce alcuni residui aminoacidici, Thr338,
Thr550 e Gln552, a relazione diretta con il fenomeno della resistenza [10].
Figura 13. 1QMF: PBP 2x [10]
Nei batteri Gram negativi la resistenza è mediata da una ridotta permeabilità della membrana
esterna associata a un rapido efflusso dell’antibiotico dallo spazio periplasmico verso la parte più
esterna della cellula. Mutazioni di geni che codificano le proteine della membrana esterna, le
porine, riducono l’ingresso dei beta lattamici all’interno delle cellule, mentre altre proteine
formano dei canali che pompano attivamente i beta lattamici fuori dalla cellula [2].
Penicilline provviste di radicali acidi costituiti da raggruppamenti voluminosi, in grado di
produrre elevati ingombri sterici, sono resistenti alle penicillasi poichè l’attacco dell’enzima
all’altezza dell’anello beta lattamico è impedito. Nelle beta lattamine penicillasi-resistenti il
gruppo acilico ingombrante è direttamente unito al carbonile, mentre in tutte le altre tra i due
gruppi è sempre interposto un metilene sostituito che, creando una maggiore distanza tra arile e
anello beta lattamico, annulla in parte l’effetto negativo prodotto dall’ingombro sterico. Inoltre
nella catena laterale, in posizione 6, le penicilline acido stabili e resistenti alle beta lattamasi
possiedono un gruppo elettron-attrattore che conferisce maggiore stabilità all’anello.
20
L’Enterocuccus faecium risulta resistente alla penicillina attraverso la sovrapproduzione di PBP5 a bassa affinità per la penicillina (Fig. 14). Soltanto una struttura di penicillina sensibile alla
PBP è stata svelata (PBP 2x da Streptococcus pneumoniae) [11].
Figura 14. PBP-5 a bassa affinità
La PBP5 resistente alla penicillina è composta da due domini: il dominio N-terminale, di cui
non è ancora nota la funzione biologica, ed il dominio C-terminale, che richiama il dominio
transpeptidasico della PBP 2x e, in maniera più generale, gli enzimi che riconoscono le
penicilline (DD-peptidasi, DD-carbossipeptidasi, beta lattamasi di classe A, C o D). Il sito attivo
è delimitato dai classici motivi costanti per queste proteine [12].
Gli studi computazionali sono stati utili per capire le differenze tra due proteine ritenute
evoluzionalmente correlate (Fig. 15): le beta lattamasi e le PBP. Si pensa che le prime derivino
dalle PBP ancestrali, anche se le due proteine mantengono la stessa struttura tridimensionale ed i
residui del sito attivo. Entrambi sono enzimi del tipo serino-proteasi. Le PBPs sono inattivate dai
beta lattami, mentre le beta lattamasi le inattivano poiché sono scarsi catalizzatori dell’idrolisi
21
per il complesso acil-enzima. Sembra che la Tyr sia essenziale per l’interazione e la
stabilizzazione del complesso tramite ponti idrogeno [13].
Figura 15. Beta lattamasi e PBPs sono evoluzionalmente correlate
4.3. Inibitori delle beta lattamasi
L’aggiunta di inibitori delle beta lattamasi (acido clavulanico, sulbactam o tazobactam)
all’ampicillina, all’amoxicillina, alla ticarcillina o alla piperacillina, allarga lo spettro
antibatterico di questi agenti a molti microrganismi che sono resistenti in virtù della produzione
di beta lattamasi. Queste specie comprendono E.coli, Klebsiella spp., tutte le specie di Proteus,
H. influenzae, Moraxella catarrhalis, Providencia spp e Bacteroides spp. Tali combinazioni
sono attive anche nei confronti degli stafilococchi che producono beta lattamasi, ma che non
sono meticillino resistenti. Tuttavia, l’efficacia di queste combinazioni nelle infezioni
stafilococciche gravi non è ancora stata adeguatamente dimostrata. Inoltre, Enterobacter,
Pseudomonas, Acinetobacter e vari ceppi Gram negativi enterici producono beta lattamasi non
inibite da questi composti o sviluppano una resistenza attribuibile a meccanismi mediati da beta
lattamasi.
L’acido clavulanico è potente inibitore irreversibile di beta lattamasi e pertanto usato spesso in
associazione con ampicillina e amoxicillina (Augumentin, Clavulin), penicilline altrimenti
sensibili all’idrolisi da beta lattamasi [2].
Sono state determinate le strutture cristalline di acido clavulanico e sulbactam legati ad una
variante di beta lattamasi SHV-1 E166A che difetta nella deacilazione (Fig. 16-17). Le strutture
22
raggi X, ottenute ad elevata risoluzione, mostrano un intermedio carbossilato in cui l’unione
covalente è al sito attivo del residuo di Ser 70. Si pensa che questo intermedio abbia un ruolo
chiave nell’inibizione transitoria delle beta lattamasi di classe A [14].
Figura 16. 2A49 Acido clavulanico e SHV-1 E166A [14]
Figura 17. 2A3U Sulbactam e SHV-1 E166A [14]
23
Una risposta batterica all’uso di inibitori di beta lattamasi di classe A come tazobactam e acido
clavulanico è indice di beta lattamasi con debole affinità di legame per questi inibitori. Alcune di
queste lattamasi resistenti agli inibitori contengono la mutazione G130S. La struttura
cristallografica del complesso tazobactam-lattamasi SHV-1 di classe A con mutazione G130S è
stata determinata con una risoluzione di 1.8 A° (Fig. 18) [15].
Figura 18. 1TDL: struttura della beta lattamasi SHV-1 [15]
24
CAPITOLO 5
5.1. Infezioni nosocomiali per antibiotico resistenza
La popolazioni batteriche resistenti prosperano in caso di elevato uso di antimicrobici, in quanto
godono di un vantaggio selettivo rispetto alle popolazioni suscettibili.
Il costo delle infezioni nosocomiali (acquisite in ospedale) è notevole. Si stima che sia
annualmente di circa 4.5 mliardi di dollari con 88 000 decessi. Sebbene le attività di controllo
delle infezioni e l’epidemiologia ospedaliera si siano ampiamente sviluppate negli ultimi 30 anni,
lo sforzo di ridurre il rischio infettivo rappresenta tuttora una sfida per il numero sempre più
elevato di pazienti immunocompromessi, la presenza di batteri antibiotico resistenti, le
superinfezioni fungine e virali, l’uso sempre più esteso di mezzi e procedure invasive.
Le infezioni nosocomiali seguono un andamento epidemiologico di base che aiuta a indirizzare
la prevenzione e le misure di controllo. I patogeni nosocomiali hanno serbatoi, seguono modalità
di trasmissione prevedibile e richiedono la presenza di ospiti suscettibili. Serbatoi e sorgenti
sono presenti nell’ambito dei materiali (per esempio rubinetti contaminati da Legionella) e in
ambito umano (per esempio operatori sanitari, pazienti o visitatori infetti o colonizzati).
Epidemie di antibiotico resistenza possono dipendere dai seguenti eventi: mutazioni
cromosomiche dei batteri per selezione darwiniana, diffusione di resistenze da plasmidi e/o
transposoni tra specie batteriche, riammissione in ospedale di pazienti cronicamente infetti con
batteri resistenti.
Dopo l’introduzione dei ceppi resistenti, la loro disseminazione avviene tramite infezioni
crociate (diffusione diretta di patogeni da un paziente ad un altro a causa del fatto che il
personale ospedaliero si lava in maniera inadeguata le mani) oppure per autoinoculazione (per
esempio aspirazione di flora orofaringea nel polmone attraverso un tubo endotracheale). Talvolta
i patogeni (per esempio gli streptococchi di gruppo A e molti virus) vengono diffusi per via
indiretta tramite contatto interpersonale a causa di goccioline infettanti liberate con gli starnuti o
la tosse.
Sebbene l’efficacia delle misure di controllo sull’uso di antibiotici nel ridurre la frequenza di
resistenza antimicrobica non sia stata dimostrata in studi prospettici randomizzati, sembra che
valga la pena limitare l’uso di particolari antibiotici a ben definite indicazioni o usare per periodi
limitati particolari classi di antibiotici al fine di limitare la pressione selettiva sulla flora
nosocomiale [2].
25
CAPITOLO 6
6.1. Conclusioni
Da quanto discusso nei capitoli precedenti, si deduce che i modelli co-cristallografici di PBP con
i vari antibiotici forniscono indicazioni importanti per la comprensione dei meccanismi di
inibizione e riconoscimento molecolare.
I dati che derivano dagli studi condotti, dimostrano chiaramente l’utilità della cristallografia
nell’indagine su PBPs e penicilline le cui conoscenze precedenti sono state completate e
arricchite con modelli e simulazioni che mostrano i meccanismi molecolari alla base delle
interazioni enzima-substrato. Attraverso simili supporti si individuano i precisi residui
aminoacidici interessati nei legami, si calcolano le distanze inter-atomiche, si misurano gli angoli
di legame e si osservano i comportamenti conformazionali delle strutture.
Inoltre, considerando i fenomeni farmacodinamici che intervengono tra microbo ed ospite
infetto, le responsabilità ed i ruoli dei singoli componenti molecolari, si potrebbe ottenere un
avanzamento nella comprensione di tali funzionamenti.
Ai fini dello sviluppo di nuovi farmaci è possibile, infine, progettare il superamento della
farmaco-resistenza con molecole sempre più efficaci, che possano aggirare ostacoli sterici e
rinforzare le affinità di binding e di adesione alle strutture batteriche.
26
CAPITOLO 7
BIBLIOGRAFIA e WEBGRAFIA
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