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Codice Documento_Edxx
Istruzione Operativa
SIT_IOP_015_ed03
Pag. 1/9
NAT
Data emissione: 10/05/06
Unità Operativa
Tipo Documento.
Numero Locale
SIT
IOP
015
Contenuto
1
2
3
SCOPO
APPLICABILITÀ
DOCUMENTI DI RIFERIMENTO
3.1
3.2
4
COLLEGATI
GENERATI
DESCRIZIONE
4.1 INTRODUZIONE
4.2 SCOPO DELLA DETERMINAZIONE
4.3 SPIEGAZIONE DEL TEST
4.4 PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
4.4.1
Preparazione dei campioni, controlli ed estrazione
4.4.2
Trascrizione inversa
4.4.3
Amplificazione del bersaglio
4.4.4
Reazione di ibridazione
4.4.5
Reazione di rivelazione
4.5 PRELIEVO, ACCETTAZIONE DEI CAMPIONI
4.6 PREPARAZIONE ED ESECUZIONE DEL TEST
4.6.1
Combinazione dei campioni
4.6.2
Preparazione del TECAN-GENESIS
4.6.3
Preparazione dei pool
4.6.4
Chiusura del TECAN Genesis
4.6.5
Manutenzione del TECAN- Genesis
4.6.6
Estrazione RNA
4.6.7
Preparazione COBAS-AMPLICOR
4.6.8
Area preparazione reagenti
4.6.9
Area estrazione
4.6.10
Esecuzione
4.6.11
Chiusura COBAS-AMPLICOR
4.6.12
Manutenzione COBAS-AMPLICOR
4.7 RISULTATI
Stato delle modifiche
Ed.
00
01
02
03
04
Descrizione modifica
Prima Edizione
Modificati paragrafi 4.3.1, 4.5 e 4.6 (rif.:scheda modifica 12/02)
Modificati punti 4.6.1 e 4.6.2 (rif scheda modif. 66/02)
Modificati punti 4.1 e 4.7 (rif scheda modif. 13/06)
Verificato
Approvato
Data
18/12/01
08/05/02
05/11/02
10/05/06
SIT_IOP_015_Ed03
1
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Scopo
Scopo di questa istruzione è descrivere le modalità di preparazione ed esecuzione del Nucleic Acid Test
(NAT) HCV e HIV sullo strumento COBAS Amplicor con kit dedicati nel settore di biologia molecolare del
SIMT.
Per tutto quanto non previsto dalla presente istruzione si faccia riferimento al manuale d’uso dello strumento.
2
Applicabilità
La presente istruzione si applica all’esecuzione del test NAT HCV e HIV su donatori
3
3.1
Documenti di riferimento
Collegati
Codice
SIT_POP_014
SIT_IMA_001
SIT_IMA_006
SIT_IMA_007
SIT_IMA_ 042
Titolo
Diagnostica Donatori
Manuale COBAS Amplicor
Manuale Amplipool
Manuale WIF
Manuale Tecan Freedom Evo
3.2 Generati
Codice
Titolo
SIT_IOP_015_Ed03
4
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Descrizione
Le caratteristiche metodologiche dell’esecuzione del test COBAS Ampliscreen HCV e quelle relative all’HIV
sono esattamente identiche, quindi quanto di seguito descritto per HCV è puntualmente trasferibile ad HIV.
4.1
INTRODUZIONE
Il test COBAS AmpliScreen HCV è un test qualitativo in vitro per la rilevazione diretta dell'RNA del virus
dell'epatite C (HCV) nel plasma umano. Risponde adeguatamente alle recenti esigenze espresse nella
Circolare Ministeriale del 30 ottobre 2000 dove viene richiesta l'introduzione della ricerca di acido nucleico del
virus dell'epatite C mediante la tecnica di amplificazione genica nei pool di plasma umano.
L'uso del kit in ambito trasfusionale è stato validato dall'Istituto Paul-Ehrlich ed in maggio ha ottenuto la
registrazione.
Il COBAS AmpliScreen HCV test è un test destinato alla rilevazione qualitativa dell'RNA dell'HCV nel plasma
e allo screening di campioni di plasma umano donato. Incorpora caratteristiche conformi ai criteri di screening
di miscele di plasma: sufficiente sensibilità da rilevare una sola unità contenente da 103 a 104 copie per ml
quando diluito con unità negative; una specificità di almeno il 99% per ridurre al minimo il numero di risultati
falsi-positivi che richiedono, per essere risolte, costose analisi dei singoli campioni compresi nei pool.
Per quanto riguarda la sensibilità e la specificità dei test, queste sono dichiarate nelle metodiche relative
inserite nei dei Kit utilizzati.
4.2
SCOPO DELLA DETERMINAZIONE
Il test è basato sulla trascrizione inversa dell'RNA bersaglio per generare un DNA complementare (cDNA),
sull'amplificazione ed ibridazione dell'acido nucleico bersaglio cDNA tramite reazione polimerasica a catena
(PCR o Polymerase Chain Reaction), al fine di rivelare la possibile presenza dell'RNA dell'HCV nel plasma.
4.3 SPIEGAZIONE DEL TEST
Il virus dell'epatite C è il principale agente eziologico responsabile del 90-95% dei casi di epatite non-A, non-B
post-trasfusione. L'HCV è un virus a filamento singolo di RNA a polarità positiva, con un genoma di circa
10.000 nucleotidi codificante 3.000 amminoacidi. Essendo un virus ematogeno, l'HCV può essere trasmesso
dal sangue e dagli emoderivati. La prevalenza globale dell'infezione da HCV, determinata con tests
immunosierologici, varia dallo 0,6% in Canada all'1,5% in Giappone.
I tests di screening sierologici hanno notevolmente ridotto, senza eliminarlo completamente, il rischio di
trasmissione delle infezioni virali a seguito di trasfusione di emoderivati. In teoria, l'analisi degli acidi nucleici
virali dovrebbe ridurre il rischio residuo di trasmissione, rilevando le donazioni effettuate durante il periodo
finestra di sieroconversione, ovvero il lasso di tempo intercorrente tra l'infezione e l'aumento degli anticorpi
antivirali. I tests basati sugli acidi nucleici dovrebbero inoltre rilevare le unità viremiche dei donatori non
reattivi sierologicamente o privi di anticorpi contro gli epitopi rilevati dai tests immunologici.
Sebbene le tecnologie correnti di analisi sull'acido nucleico non hanno un rendimento sufficiente per testare
unità individuali ad un costo ragionevole, sono state avanzate alcune proposte di analisi dell'acido nucleico su
miscele derivanti da aliquote tratte da campioni individuali. L'elevata sensibilità della PCR ha dimostrato che è
possibile rilevare donazioni potenzialmente infette comprese in mini pool nelle quali sia presente anche una
sola unità viremica.
4.4 PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Il test COBAS AmpliScreen HCV-HIV prevede cinque fasi principali:
1)
2)
3)
4)
5)
preparazione dei campioni e dei controlli ed estrazione dell'RNA virale;
trascrizione inversa dell'RNA bersaglio per generare un DNA complementare (cDNA);
amplificazione tramite PCR del cDNA bersaglio usando primer complementari specifici all'HCV;
ibridazione dei prodotti amplificati con sonde oligonucleotidiche specifiche al bersaglio;
rivelazione dei prodotti amplificati legati alla sonda tramite determinazione colorimetrica.
Il test COBAS AmpliScreen HCV permette le simultanee trascrizione inversa e amplificazione PCR dell'RNA
bersaglio dell'HCV e dell'RNA del controllo interno CI. Il reagente Master Mix contiene un paio di primer
specifici all'RNA sia dell'HCV che del relativo CI. La rivelazione di DNA amplificato viene eseguita usando
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sonde oligonucleotidiche specifiche al bersaglio, le quali permettono di identificare in modo indipendente
l'amplicon dell'HCV e l'amplicon del CI. La rivelazione del DNA amplificato del CI viene effettuata per
garantire l'integrità del processo di estrazione ed amplificazione.
4.4.1 Preparazione dei campioni, controlli ed estrazione
Il test COBAS AmpliScreen HCV prevede la sedimentazione delle particelle virali dell'HCV tramite
centifugazione ad alta velocità del plasma, seguita da lisi del pellet virale tramite un agente caotropico e da
precipitazione dell'RNA in alcool.
Nei processi enzimatici di amplificazione tipo la PCR, l'efficienza può essere ridotta da inibitori eventualmente
presenti nel campione. Il Controllo Interno (CI) è stato aggiunto al test COBAS AmpliScreen HCV per
consentire di identificare i campioni trattati che contengano sostanze pontenzialmente interferenti con
l'amplificazione tramite PCR. Il CI è un trascritto di RNA con regione di legame per i primer identiche a quelle
della sequenza HCV bersaglio, una sequenza interna randomizzata di lunghezza e composizione di basi
simile alla sequenza HCV bersaglio ed una regione unica di legame della sonda che differenzia l'amplicon del
CI dall'amplicon bersaglio.
Queste caratteristiche sono state selezionate per garantire l'equivalenza dell'amplificazione dell'RNA del CI e
dell'RNA del bersaglio. L'RNA del CI viene introdotto in ciascun campione assieme al reagente di lisi
multipreparato e funge da controllo dell'estrazione e dell'amplificazione di ciascun campione e controllo
trattato.
4.4.2
Trascrizione inversa
4.4.2.1 Selezione del bersaglio
La selezione della sequenza RNA bersaglio dell'HCV dipende dall'identificazione delle regioni che
evidenziano la massima conservazione della sequenza all'interno del genoma dell'HCV tra i vari genotipi
HCV. Di conseguenza l'appropriata selezione dei primer e della sonda è cruciale ai fini della rilevazione da
parte del test di tutti i genotipi. La regione 5' non tradotta del genoma HCV è stato dimostrato presentare la
massima conservazione della sequenza RNA rispetto a tutti i genotipi HCV conosciuti. Il test COBAS
AmpliScreen HCV utilizza primer KY78 e KY80 per definire una sequenza di 244 nucleotidi all'interno della
regione 5' non tradotta altamente conservata del genoma HCV. La sequenza della sonda di cattura e le
sequenze dei primer sono situate nei dominii più conservati della regione 5' non tradotta.
4.4.2.2 Trascrizione inversa
Le reazioni di trascrizione inversa e di amplificazione vengono svolte tramite DNA polimerasi dell'enzima
ricombinante termostabile Thermus thermophilus (rTth pol). In presenza di manganese e nelle appropriate
condizioni di tamponatura, l'rTth pol svolge attività sia di trascrittasi inversa che di DNA polimerasi. Ciò
consente la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR nella stessa miscela di reazione.
I campioni trattati vengono addizionati alla miscela di amplificazione nelle provette di amplificazione ("ATube") in cui si verifica sia la trascrizione inversa che l'amplificazione PCR. Il primer a valle o antiparallelo
(KY78) viene biotinilato in corrispondenza alla posizione terminale 5'; il primer a monte o parallelo (KY80) non
viene biotinilato. La miscela di reazione viene riscaldata per permettere al primer a valle di appaiarsi in modo
specifico all'RNA bersaglio dell'HCV ed all'RNA del CI. In presenza di Mn 2+ e di un eccesso di trifosfati di
deossinucleosidi (dNTP), comprendenti trifosfati di deossiadenosina, deossiguanosina, deossicitidina e
deossiuridina (al posto della timidina), l'rTth poi estende il primer appaiato formando un filamento di DNA
complementare (cDNA) all'RNA bersaglio.
4.4.3 Amplificazione del bersaglio
Dopo la trascrizione inversa dell'RNA bersaglio dell'HCV e dell'RNA del CI, la miscela di reazione viene
riscaldata per denaturare l'ibrido RNA-cDNA ed esporre le sequenze bersaglio dei primer. Man mano che la
miscela si raffredda, il primer a monte (KY80) si appaia in modo specifico al filamento di cDNA, l'rTth poi
estende il primer e viene sintetizzato un secondo filamento di DNA.
Ciò completa il primo ciclo della PCR, producendo una copia di DNA a doppio filamento della regione
bersaglio dell'RNA dell'HCV e del CI. La miscela di rezione viene riscaldata un'altra volta per separare il DNA
a doppio filamento risultante ed esporre le sequenze del primer. Man mano che la miscela si raffredda, i
primer KY78 e KY80 si appaiano al DNA bersaglio. L'rTth poi, in presenza di Mn2+ e di un eccesso di dNTP,
estende i primer appaiati lungo gli stampi bersaglio, producendo una molecola di DNA a doppio filamento
lunga 244 coppie di basi detta amplicon. L'analizzatore COBAS AMPLICOR ripete automaticamente questo
processo per un dato numero di cicli, raddoppiando ad ogni ciclo la quantità di DNA dell'amplicon. Il numero
di cicli richiesto viene programmato dall'analizzatore COBAS AMPLICOR. L'amplificazione si verifica
solamente nella regione del genoma HCV compresa tra i primer, senza amplificare l'intero genoma dell'HCV.
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Amplificazione selettiva
Il test COBAS AmpliScreen HCV consente l'amplificazione selettiva dell'acido nucleico bersaglio del
campione grazie all'uso di AmpErase (uracil-N-glicosilasi, UNG) e di trifosfato di deossiuridina (dUTP).
L'AmpErase riconosce e catalizza la distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina, ma non del
DNA contenente deossitimidina. La deossiuridina non è presente nel DNA formatosi naturalmente, ma è
sempre presente nell'amplicon a causa dell'uso di trifosfato di deossiuridina al posto del trifosfato di timidina
quale uno dei dNTP del reagente Master Mix. Di coseguenza, solo l'amplicon contiene deossiuridina. Questa
desossiuridina rende l'amplicon contaminante suscettibile alla distruzione da parte dell'AmpErase prima
dell'amplificazione del DNA bersaglio. L'AmpErase, che è incluso nel reagente Master Mix, catalizza la
rimozione della deossiuridina presente nel DNA in residui di deossiuridina aprendo la catena di deossiribosio
in corrispondenza della posizione C1. Una volta riscaldata nel corso della prima fase del ciclo termico (in
condizioni di pH alcalino di Master Mix), la catena di DNA dell'amplicon si rompe in corrispondenza della
posizione di deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'AmpErase è inattivo a temperature superiori
a 55°C, ovvero durante le fasi del ciclo termico, e pertanto non distrugge l'amplicon bersaglio. Dopo
l'amplificazione, qualsiasi enzima residuo viene denaturato tramite addizione della soluzione di
denaturazione, impedendo così la degradazione dell'amplicon bersaglio. L'AmpErase del test COBAS
AmpliScreen HCV, è stato dimostrato capace di disattivare almeno 1.000 copie dell'amplicon dell'HCV
contenente deossiuridina per PCR.
4.4.4 Reazione di ibridazione
Dopo l'amplificazione tramite PCR, l'analizzatore COBAS AMPLICOR addiziona automaticamente la
soluzione di denaturazione nelle "A-Tube" per denaturare chimicamente l'amplicon dell'HCV e l'amplicon del
CI in modo da formare DNA a singolo filamento. Aliquote di amplicon denaturato vengono successivamente
trasferite nelle coppette di rivelazione (D-Cups). Una sospensione di particelle magnetiche rivestite con una
sonda oligonucleotidica specifica all'amplicon dell'HCV (KY150) o all'amplicon del CI (SK535) viene
addizionata in ciascuna D-Cup. L'amplicon dell'HCV marcato con biotina e quello del CI vengono ibridati alle
sonde oligonucleotidiche bersaglio-specifiche legate alle particelle magnetiche. Tale ibridazione dell'amplicon
con la sonda bersaglio-specifica aumenta la specificità complessiva del test.
4.4.5 Reazione di rivelazione
Dopo la reazione di ibridazione l'analizzatore COBAS lava le particelle magnetiche nelle D-Cups per
rimuovere il materiale non legato e poi addiziona il coniugato di avidina-perossidasi di rafano. Tale coniugato
si lega all'amplicon marcato con biotina, ibridato alle sonde oligonucleotide specifiche al bersaglio (HCV o CI)
legate alle particelle magnetiche. L'analizzatore rimuove il coniugato non legato tramite lavaggio delle
particelle magnetiche e poi addiziona in ciascuna D-Cup una soluzione di substrato contenente acqua
ossigenata e TMB (Tetrametilbenzidina). In presenza di acqua ossigenata, la perossidasi di rafano legata alle
particelle catalizza l'ossidazione della TMB formando un complesso colorato la cui assorbanza viene misurata
dall'analizzatore ad una lunghezza d'onda di 660 nm.
SIT_IOP_015_Ed03
4.5
Pag.: 6/9
PRELIEVO, ACCETTAZIONE DEI CAMPIONI
A. Prelievo dei campioni
Il test COBAS AmpliScreen HCV viene eseguito solamente su campioni di plasma. Il sangue deve essere
raccolto usando l'anticoagulante EDTA. Il campione non deve rimanere a temperatura ambiente per più di 8
ore, altrimenti va conservato a 2-10°C e il plasma va separato dagli eritrociti entro 72 ore dal prelievo per
centrifugazione a 800-1600 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.
B. Accettazione dei campioni
Sull’etichetta che accompagna ogni campione compare il numero della sacca (CDM) e l’ospedale di
provenienza.
Prima di eseguire il test è necessario verificare la corrispondenza tra i numeri presenti sulle provette e quelli
sulla lista di lavoro.
4.6
PREPARAZIONE ED ESECUZIONE DEL TEST
4.6.1 Combinazione dei campioni
Inizialmente si esegue il test COBAS AmpliScreen HCV su pool di donatori (il pool può essere costituito al
massimo da 20 plasmi prelevati da donatori) preparati sullo strumento TECAN-GENESIS; a seconda del
numero di pool che si è stabilito di preparare si usa il sistema gestionale Amplipool per stampare le relative
etichette che riportano in formato BARCODE il giorno, il mese e il N. del pool. Queste etichette verranno poi
lette dal TECAN al momento della preparazione dei pool. Per quanto riguarda le modalità d’uso del sistema
Amplipool si faccia riferimento ai relativi manuali (SIT_IMA_006/7)
Se una combinazione (pool) risulta positiva è necessario testare singolarmente ogni campione di quel pool
per individuare il donatore positivo.
L’HIV viene determinato invece sui singoli campioni e di conseguenza il sistema Amplipool non viene
utilizzato.
4.6.2 Preparazione del TECAN-GENESIS
Per quanto riguarda le modalità di preparazione all’utilizzo dello strumento TECAN Genesis si faccia
riferimento al relativo manuale d’uso (SIT_IMA_ 042 ).
4.6.3 Preparazione dei pool
1. Le provette centrifugate dei campioni vengono stappate e poste sui relativi racks seguendo la numerazione
delle liste di lavoro.
2. I racks così preparati vengono inseriti sul TECAN, il quale provvede alla composizione dei pool e della
piastra di archiviazione dei singoli plasmi.
3. Alla fine della preparazione di ogni pool, il TECAN stampa il report contenente il CDM dei singoli campioni
presenti nel pool e, alla fine dell’archiviazione, stampa il report che individua la posizione del singolo
plasma (identificato dal relativo CDM) sulla piastra di archivio.
Tramite Amplipool si ricevono i dati relativi ai campioni da analizzare (il N. del pool e i CDM relativi ad ogni
campione presente nel pool) che verranno poi trasmessi al Cobas in uso.
4.6.4 Chiusura del TECAN Genesis
Al termine della preparazione dei pool e della piastra,lo strumento viene spento previo lavaggio eseguito
secondo quanto descritto nel relativo manuale.
4.6.5 Manutenzione del TECAN- Genesis
Giornaliera
- eseguire un paio di lavaggi all’inizio ed alla fine della seduta di analisi
- controllare i livelli delle taniche del liquido di lavaggio (acqua distillata) e dello scarico
- lavare la stazione di lavaggio con acqua distillata
Settimanale
- pulire i racks
- pulire il piano di lavoro
- pulire lo scarico dei puntali
SIT_IOP_015_Ed03
Pag.: 7/9
4.6.6 Estrazione RNA
Per la preparazione dei reagenti e per l’estrazione dell’RNA (vedi in seguito) si lavora sotto cappa a flusso
laminare in due aree distinte per evitare eventuali contaminazioni.
4.6.7 Preparazione COBAS-AMPLICOR
Per quanto riguarda le modalità di preparazione all’utilizzo dello strumento COBAS Amplicor si faccia
riferimento al relativo manuale d’uso (SIT_IMA_001)
I reagenti da utilizzare sono in parte pronti all’uso ed in parte da preparare al momento.
Per l’elenco dei reagenti da utilizzare e la eventuale preparazione necessaria, riferirsi al manuale d’uso dello
strumento (SIT_IMA_001).
4.6.8 Area preparazione reagenti
I reagenti da utilizzare sono in parte pronti all’uso ed in parte da preparare al momento.
Per l’elenco dei reagenti da utilizzare e la eventuale preparazione necessaria, riferirsi al manuale d’uso dello
strumento (SIT_IMA_001).
1. Calcolare il numero di pool da analizzare, predisporre il numero di "A-Ring" necessari ed alloggiarli sugli
appositi supporti.
2. Preparare la specifica Master Mix pipettando 100 µl di HCV Mn2+ nella provetta di MMX;
3. Agitare per inversione la soluzione di Master Mix e distribuirne 50 µl all'interno di ogni "A-Tube",
lasciandolo poi aperto.
4. Nel caso di non immediato utilizzo l' "A-Ring" così preparato ed inserito nell’apposito sacchetto di plastica,
rimane stabile a 2-8°C per non più di 4 ore.
4.6.9 Area estrazione
1.
Preparare 1 provetta di estrazione per CP, 1 provetta per il CN e contrassegnare ogni provetta dei pool
con il relativo numero.
2.
Condizionare la centrifuga ad una temperatura compresa tra 2-8°C.
3.
Agitare bene su vortex le provette di NHP e quelle dei pool. Pipettare 1 ml di NHP in ogni provetta
dedicata ai controlli.
4.
Centrifugare tutte le provette a 2-8°C per 60 minuti, ad una velocità di 23.600 x g avendo cura di
posizionare ogni provetta con il numero verso l'alto. Il pellet costituito da materiale corpuscolato e da
particelle virali si depositerà sul fondo della provetta, in corrispondenza del lato contrassegnato.
5.
Durante la centrifugazione predisporre quantità sufficienti di isopropanolo ed etanolo al 70%. Portare
MP LYS a T.A. avendo cura che si sciolgano tutti i cristalli in esso presenti, quindi aggiungerci 100 µl di
MP IC. Questa soluzione risulta stabile per 4 ore a T.A.
6.
Dopo la centrifugazione rimuovere lentamente da tutte le provette 900 l circa di surnatante evitando di
spingere il puntale fino al fondo della provetta, per non intaccare il pellet.
7.
Pipettare in ogni provetta 600 µl di MP LYS agitando su vortex ogni volta che se ne aggiunge
un'aliquota in una provetta.
8.
Agitare per 10 secondi su vortex le provette dei due controlli specifici. Pipettare 20 µl di CN e CP nelle
rispettive provette contenenti il residuo di NHP ed i 600 µl di MP LYS.
9.
Incubare le provette dei campioni e dei controlli a T.A. per 10 minuti. Durante questa incubazione
avviene la lisi delle particelle virali. Al termine dell'incubazione agitare le provette su vortex.
10. Aggiungere 700 µl di isopropanolo in ogni provetta, agitando su vortex ogni volta che si aggiunge una
singola aliquota di alcool.
11. Centrifugare per 15 minuti alla massima velocità (12.500-16.000 x g) a T.A. posizionando ogni provetta
nella centrifuga con il numero verso l'alto. Durante la centrifugazione si ha la precipitazione degli acidi
nucleici e il pellet costituito da materiale corpuscolato e particelle virali si deposita sul fondo in
corrispondenza del lato contrassegnato.
12. Eliminare il surnatante per inversione. In questa fase il pellet potrebbe non essere ancora visibile.
13. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% in ogni provetta agitando su vortex ogni volta che si aggiunge una
singola aliquota di alcool. L'etanolo concentra e rende perfettamente visibile il pellet di detriti proteici ed
acidi nucleici.
14. Centrifugare per 5 minuti alla massima velocità (12.500-16.000 x g) a T.A.
15. Eliminare per inversione tutto il surnatante.
16. Centrifugare tutte le provette alla max velocità per alcuni secondi (procedura di "spinning"). Tale
procedura consente di raccogliere sul fondo delle provette le rimanenti goccioline di etanolo ancora
presenti sulle pareti e sulla superficie inferiore dei tappi.
17. Eliminare completamente il surnatante ponendo l'estremità della pipetta sul lato opposto a quello
contrassegnato. L'etanolo deve essere completamente rimosso perché inibisce l'attività della rTth.
SIT_IOP_015_Ed03
18.
19.
Pag.: 8/9
Aggiungere 200 µl di MP DIL ad ogni provetta avendo cura di risospendere in modo ottimale il pellet
presente sul fondo e agitando su vortex ogni volta che si aggiunge un'aliquota di diluente. Il campione
così estratto deve essere amplificato entro 2 ore oppure conservato ad almeno -70°C per non più di un
mese.
Pipettare 50 µl di campione e di controllo nei rispettivi "A-Tubes. Chiudere ermeticamente gli "A-Tubes".
Dopo aver unito gli estratti alla Master Mix l'amplificazione deve iniziare entro 20 minuti.
4.6.10 Esecuzione
Amplificare su COBAS AMPLICOR secondo le modalità descritte nel manuale d’uso dello strumento
(SIT_IMA_001).
Lo strumento dopo l’amplificazione passa automaticamente alla fase di rivelazione e stampa i risultati in valori
di assorbanza.
4.6.11 Chiusura COBAS-AMPLICOR
Al termine dell’esecuzione delle analisi lo strumento viene spento previo lavaggio eseguito secondo quanto
descritto nel relativo manuale
4.6.12 Manutenzione COBAS-AMPLICOR
Come raccomandato dal manuale d’uso, lo strumento è sottoposto alle seguenti manutenzioni:
Giornaliera
 Controllare e riempire la tanica della soluzione di lavaggio
 Controllare e svuotare la tanica dei reflui
 Controllare e pulire la torretta di inizializzazione
 Controllare e pulire la pinza delle D-Cups
 Eseguire un lavaggio prima di iniziare la seduta e alla conclusione della stessa
 Durante il lavaggio controllare siringhe e tubi aspirazione/risospensione e controllare l’ago del
campionatore
Settimanale
 Svuotare completamente la tanica della soluzione di lavaggio e sciacquarla con acqua distillata
 Riempirla con della nuova soluzione di lavaggio
 Eseguire un extended prime
Mensile
 Rimuovere e pulire alloggiamento dei racks dei reagenti e delle D-Cups
 Sostituire il filtro del pescante della tanica della soluzione di lavaggio
 Eseguire un extended prime
Bimestrale
 Rimuovere e pulire la Wash-Wheel
 Sostituire i Syringe Tip e gli O-Ring
 Eseguire un extended prime
Semestrale
 Sostituire l’Aspiration Tip and Tubing
 Sostituire il Resuspension Tip and Tubing
 Sostituire il Transfer Tip
Le operazioni di manutenzione eseguite vengono registrate sull’apposito modulo dal tecnico che le esegue
apponendovi la propria sigla.
4.7
RISULTATI
I risultati vengono riportati in valore di assorbanza ( = 660 nm) riferita a quella del bianco dello strumento.
Il sistema COBAS AMPLICOR confronta i valori di assorbanza del campione con valori preimpostati,
determinando se il test è positivo/ negativo/dubbio.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
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Pag.: 9/9
ASS. CAMPIONI
HCV
>= 1.0
ASS. CAMPIONI
HIV
>= 1,0
ASS. C.I.
INTERPRETAZIONE
>= 0,2
risultato corretto
< 1.0
< 0,1
qualsiasi
risultato non accettabile, ripetere
la seduta
CONTROLLO
NEGATIVO
< 0,1
< 0,2
>= 0,2
risultato corretto
>= 0,1
>= 0,2
qualsiasi
risultato non accettabile, ripetere
la seduta
CAMPIONI
< 0.20
> 0,2
>= 0.20
campione presumibilmente
negativo per HCV e HIV
< 0.20
< 0,2
< 0.20
campione inibito, ripetere la
seduta
>= 0.75
>= 0,2
qualsiasi
campione positivo per HCV e HIV
qualsiasi
campione dubbio, considerare
come positivo per HCV; ripetere la
seduta
CONTROLLO
POSITIVO
>= 0.20 e
< 0.75