Notes Very nice work made by Valentina

pH: scala di misura dell'acidità o dell'alcalinità di una soluzione
pI: valore di pH al quale la molecola non reca alcuna carica elettrica netta
Effetti del pH sulla carica delle catene laterali degli AA:
a pH>12: gruppi carbossili, -OH fenolici e -SH sono ionizzati, gruppi amminici sono deprotonati
a pH=3: gruppi carbossili, -OH fenolici e -SH sono neutri, gruppi amminici sono protonati
a pH neutro, quasi tutti carbossili e ammici sono carichi
nel calcolo della carica totale di una proteina, i residui di Cys non vengono calcolati perchè gli -SH sono
ingaggiati in ponti disolfuro (non sono liberi). anche gli -OH di Tyr non sono considerati perchè le proteine
hanno punti isoelettrici inferiori a pH 7 (vengono considerati solo per proteine molto basiche)
andamento della curva di titolazione di un macroione anfotero. il pI (punto isoelettrico) è il valore di pH
all'intersezione della curva di titolazione con l'asse delle x. poichè a valori di pH>pI la proteina assume carica
netta negativa va purificata su uno scambiatore anionico, viceversa su uno cationico
il sephadex è una matrice di supporto per scambiatori ionici, è una matrice di destrani cross-legati con
epicloridina. senza gruppi di scambio, la matrice è usata come setaccio molecolare che separa le macromolecole
in base alla taglia
una proprietà degli scambiatori ionici è che la capacità reale di assorbire proteine (ben diversa dalla capacità
totale) aumenta al diminuire della massa molecolare delle specie proteiche
un metodo empirico per determinare la capacità di carico di una proteina ad uno scambiatore ioni in funzione di:
pH del tampone di caricamento, concentrazione salina del tampone, equivalenti di scambio disponibili sulla
resina. Il metodo consiste in una serie di esperimenti a carico sempre maggiore dove si osserva l'assorbimento
della proteina.
la conoscenza a priori delle curve di titolazione delle proteine nella miscela da separare dà informazioni
prezione sulla scelta dello scambiatore e sul pH operativo
per ottenere curve di "titolazione elettroforetiche" si utilizza una metodica bidimensionale che abbina
un'isoelettrofocalizzazione ad un'elettroforesi zonale perpendicolare alla prima dimensione. La seconda
dimensione è una "zonale" unica in quanto avviene in un gradiente continuo di pH reso stazionario dal focusing
della prima dimensione. in questo modo le proteine nella seconda dimensione sono continuamente titolate e
tracciano la loro curva di "mobilità vs il pH" nel gel stesso.
Nell’elettroforesi zonale, o su supporto solido, la migrazione e la separazione delle molecole avvengono tra i
pori di un supporto solido, il più possibile inerte. Le varie specie molecolari si separano in bande o zone
localizzate in posizioni diverse sul supporto. L’elettroforesi zonale presenta notevoli vantaggi:
necessita di apparecchiature semplici, costituite da vaschette per migrazione elettroforetica corredate di
alimentatore e potenziometro
richiede un volume di materiale (campione) molto ridotto (2-50μm)
consente di separare i componenti della miscela in zone distinte così da poterli rilevare con tecniche analitiche
chimiche o fisiche.
Inoltre è anche possibile, dopo la separazione elettroforetica, ricorrere alla combinazione di tecniche
particolari come l’immunodiffusione. In generale i supporti devono essere permeabili alle sostanze da separare,
inerti e non interferire con i metodi di rivelazione.
tra i TAMPONI più COMUNEMENTE USATI ci sono:
- Good's buffers: tamponi anfoteri sintetizzati da Good già negli anni '60 (MES, ADA, MOPS, HEPES, Bicine).
la loro caratteristica è di possedere gruppi amminici con pK graduati nell'intervallo di pH 4-10
- tamponi usati nella cromatografia a scambio anionico (DEAE, QAE). in genere tamponi con pK tra 6.5 e 8.5 si
usano con DEAE, mentre quelli più elevati con QAE
- tamponi volatili: importanti per la spettrometria di massa di proteine. per essere volatili bisogna che sia lo ione
tamponante che quello titolante siano volatili
Sephadex: il polisaccaride destrano viene cross-legato con epicloridrina in ambiente alcalino
le sephadex sono polimeri neutri e formano una serie in cui la G indica la "gel filtrazione" e il numero il "fattore
di rigonfiamento" o il "guadagno in acqua"
Sephadex is a trademark for cross-linked dextran gel used for gel filtration. The name is derived from
separation Pharmacia dextran. It is normally manufactured in a bead form and most commonly used for gel
filtration columns. By varying the degree of cross-linking, the fractionation properties of the gel can be altered.
These highly specialized gel filtration and chromatographic media are composed of macroscopic beads
synthetically derived from the polysaccharide, dextran. The organic chains are cross-linked to give a three
dimensional network having functional ionic groups attached by ether linkages to glucose units of the
polysaccharide chains. Available forms include anion and cation exchangers, as well as gel filtration resins,
with varying degrees of porosity; bead sizes fall in discrete ranges between 20 and 300 µm.
Superdex (altro supporto per gel filtrazione): polimero misto di fibre di agarosio (supporto rigido) altamente
cross-legato con filamenti di destrano legati covalentemente che riempieno le cavità tra le fibre di agarosio
dando origine al setacciamento delle proteine (intervallo di setacciamento da 10kDa a 600kDa
Sephacryl (matrice idrofila ad alta resistenza meccanica): allil destrani cross-legati con N.N'-metilene
bisacrilamide. intervallo di setacciamento da 20kDa a 8000kDa e stabile tra pH 3 e 11. Può essere operata in
SDS, 8M urea e 6M guanidina HCl
Sepharose: catene di agarosio gelificate tramite legame a idrogeno. il disaccaride "galattosio" è l'unità base unito
a 3,6-anidro-L-galattosio. quado la polvere è sciolta a 100°C e poi raffreddata si formano doppie eliche che poi
si aggregano in pilastri di 7-11 doppie eliche. questo porta alta porosità: intervallo di setacciamento da 70kDa a
40000kDa
Sepharose is a tradename for a crosslinked, beaded-form of agarose, a polysaccharide polymer material
extracted from seaweed. Iodoacetyl functional groups can be added to selectively bind cysteine side chains and
this method is often used to immobilize peptides. Its brand name is derived from Separation-PharmaciaAgarose. A common application for the material is in chromatographic separations of biomolecules.
Sepharose/agarose, combined with some form of activation chemistry, is also used to immobilize enzymes,
antibodies and other proteins and peptides through covalent attachment to the resin.[1] Common activation
chemistries include cyanogen bromide (CNBr) activation and reductive amination of aldehydes to attach
proteins to the agarose resin through lysine side chains.
le resine per gel filtrazione vengono utilizzate col seguente schema:
-resina impaccata tra due pistoni mobili, per eliminare ogni battente di tampone dove finisce il letto delle
sferette
-eluato monitorato in continuo da rilevatore UV
-segnale inviato a registratore
-marcatore di eventi permette di individuare con precisione i picchi raccolti nel collettore di frazioni
struttura dei granuli di sephadex
il setacciamento avviene tra il volume a vuoto V0 e il volume totale del letto di resina Vt (Vc=volume della
colonna). ogni frazione eluita è caratterizzata da un valore di volume di eluizione Vr. il coefficiente di
distribuzione Kd rappresenta la frazione di fase stazionaria disponibile ad un dato soluto. in base alle dimensioni
dell'analita, il Kd varia tra 0 (molecola completamente esclusa) e 1 (molecola completamente inclusa)
Il grafico Kav vs log(Mr) dà la curva di selettività della matrice. Tarando la curva con proteine globulari ad Mr
noto, si può risalire ad Mr di proteine incognite. si noti che l'intervallo di linearità varia tra Kav ca. 0.8 e 0.2. in
questo intervallo la misura di Mr è molto più precisa rispetto alle zone in cui la curva si appiattisce
l'intervallo di frazionamento di proteine globulari (native) è molto più ampio rispetto a quello di proteine
denaturate a parità di tipo di resina. per cui molecole con lo stesso Mr ma con forme tridimensionali diverse
eluiscono a valori diversi di Kav e quindi a valori diversi di Mr apparente
uso della gel filtrazione per studi di lingand binding tra macromolecole e metaboliti
la colonna viene equilibrata con molarità note di analita, mentre la proteina è stripped, cioè viene caricata in
colonna in assenza di ligando. la proteina si saturerà di ligando ed eluendo in un volume vicino al V0 si lascia
alle spalle una regione svuotata di ligando. dal profilo di uscita si vede il picco di proteina (RNAsi pancreatica)
con acido 2'-citidilico (ACT) legato. in coda esce un picco negativo di ACT la cui integrazione dà la
stechiometria di legame (moli di ligando per mole di proteina). si potrebbe anche integrare il picco proteico ma
siccome il monitoraggio è fatto da 285 nm non è possibile discriminare tra l'assorbanza proteica e quella del
metabolita
uno degli usi più frequenti della gel filtrazione è per la desalificazione (o cambiamento di tipo di tampone) delle
proteine. questo processo si usa alla fine di uno schema di purificazione per scambiare un tapone cromatografico
con uno biocompatibile per proteine da rDNA da usare in terapia umana
un altro uso della gel filtrazione è il "final polishing step" che consiste, dopo un intero processo di purificazione,
nell'eliminare eventuali prodotti di oligomerizzazione (che quindi vengono eluiti prima del picco principale)
oppure prodotti di parziale degradazione proteolitica (che vengono eluiti in coda)
Reversed Phase, High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)
RP-HPLC is a technique in analytic chemistry used to separate the components in a mixture, to identify each
component, and to quantify each component. It relies on pumps to pass a pressurized liquid solvent containing
the sample mixture through a column filled with a solid adsorbent material. Each component in the sample
interacts slightly differently with the adsorbent material, causing different flow rates for the different
components and leading to the separation of the components as they flow out the column.
ritenzione di proteine in RP-HPLC
le proteine entrano nella colonna HPLC e si adsorbono alla superfiecie idrofobica. a causa della sua dimensione
solo una porzione della proteina (il piede idrofobico) si lega all'adsorbente. quando la concentrazione esatta di
solvente organico raggiunge la zona proteica, la proteina si stacca dalla superficie ed inizia a migrare giù per la
fase stazionaria
nella ritenzione di proteine le piccole molecole si legano e slegano alla fase stazionaria idrofobica in un ampio
intervallo di concentrazione di eluente organico, mentre le macromolecole presentano una curva di ritenzione
(K' = coefficiente di adsorbimento) estremamente rapida. questo comporta che la separazione delle proteine
avvenga in condizioni di massima risoluzione
la miglior fase organica su cui separare polipeptidi dipende dalla loro taglia ed idrofobicità. i peptidi si separano
meglio su sferette a pori ampi (30nm diam) e con fase ad alta idrofobicità (C18). per separare le proteine
(Mr>10kDa ) la fase preferibile è una catena butilica (C4)
le sferette di silice sono tra i supporti inerti più usati. la silice contiene silanoli isolati, geminali e vicinali e
gruppi etere che si possono idrolizzare a silanoli vicinali. i ligandi a catena idrocarburica (C8, C18) vengono
legati alla silice tramite reagenti clorotrialchilsilani. poichè non tutti i silanoli sono derivatizzati, quelli residui
vengono bloccati con piccoli reagenti alchilsilanici (catena C2). silanoli liberi sono deleteri perchè ionizzano già
a pH aciduli (5,2-6,2) e darebbero origine a separazioni miste tipo RP e IEC
altro tipo di resina per RP-HPLC è il polistirene, utilizzato nella forma solfonata come scambiatore cationico
nell'analizzatore automatico di aminoacidi. il polistirene ha eccellente stabilita chimica tra pH 1 e 12 e pertanto
può essere usato a pH alcalino (>7,5) dove la silice si idrolizza. poichè la superficie di questa resina è già
idrofobica non viene derivatizzata. la si ottiene co-polimerizzando un monomero mono-funzionale (stirene) in
presenza di un cross-legante (5-8%) il divinil-benzene
il pH influisce sui profili di eluzione dei peptidi (meglio se basso). il TFA (acido trifluoroacetico) è tra i migliori
"ion-pairing agents".
a temperature più elevate la viscosità del solvente e la pressione sulla colonna diminuiscono
la risoluzione migliore si ottiene con sferette di taglia più piccola possibile (microm)
l'eluzione di polipeptidi da RP-HPLC si ottiene con solventi acquosi a concentrazioni crescenti di modificatore
organico e di un agente "ion-pariring". il modificatore organico più comunemente usato è l'acetonitrile (ACN)
perchè è volatile, ha bassa viscosità e minima assorbanza a 215nm. gli altri solventi organici vengono usati solo
occasionalmente in RP-HPLC. isopropanolo è molto efficace nell'eluire proteine idrofobiche ma ha elevata
viscosità e quindi provoca pressioni elevate sulle colonne. perciò non è usato da solo ma aggiunto in piccole
dosi (fino al 25%) all'ACN. una tipica fase mobile per proteine è un gradiente da 20 a 80 % di ACN in acqua
con 0.1% TFA mentre per peptidi è un gradiente da 10 a 60 % ACN in acqua con 0.1% TFA
per formare i gradienti nelle colonne di RP-HPLC ci sono due modi: la "binary pump" quando si opera solo con
due reservoirs e la "proportioning valve" quando si opera con tre o più eluenti
in tutti i casi i solventi si mescolano in una piccola camera di miscelamento. la valvola a 4 canali si apre e
chiude sui vari reservoirs per tempi prestabiliti da programmi di gradiente computerizzati
la desalificazione (o scambio di tamponi) è usata di routine per eliminare contaminanti salini a basso Mr da
soluzioni di macromolecole. in gel filtrazione, si usa una sephadex G25 per proteine e una G10 per peptidi. le
macromolecole eluiscono in testa ed i sali in coda. lo svantaggio è che la proteina è recuperata diluita. in RPHPLC succede l'opposto, i sali vengono eluiti subito in fase di caricamento mentre proteine e peptidi sono
adsorbiti. lavata la colonna i polipeptidi vengono eluiti semplicemente con acetonitrile (solvente organico
volatile). quindi sono eluiti molto concentrati. questa metodica è l'unica utilizzata nell'analisi proteomica di
digeriti triptici ottenuti da proteine eluite da mappe 2D
RP-HPLC separa in base all'idrofobicità mentre IEC separa in base alla carica superficiale delle proteine. le due
metodiche sono complementari ed ortogonali (i due parametri su cui si basa la separazione sono indipendenti tra
di loro) e pertanto presentano sinergie nell'analisi e purificazione di proteine e peptidi. se usate in parallelo
offrono conferma reciproca dei risultati, se usate in serie offrono capacità separative aumentate
tecnica MudPIT (multidimensional protein identification technology)
le proteine sono isolate da un lisato cellulare e quindi vengono interamente digerite a peptidi con tripsina. il
digerito viene adsorbito su resina scambiatrice cationica forte. i peptidi sono eluiti con un gradiente a scalini di
acetato d'ammonio e adsorbiti direttamente su una reversed-phase (RP). i peptidi eluiti vengono analizzati su
ESI-MS (spettrometria di massa con electro-spray ionization) per ottenerne la massa accurata e successivamente
tramite MS/MS frammentazione per ottenerne la sequenza. per identificare le proteine presenti nel lisato
cellulare iniziale, i dati si paragonano a banche dati proteiche con il programma SEQUEST
teoria di Hydrophobic interaction chromatography (HIC)
È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro
idrofobicità di superficie. I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le
molecole d’ acqua ordinate. Le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste
regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. È una
cromatografia che è vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato. L’eluizione
può essere fatta con forza ionica decrescente oppure per “spiazzamento” con detergenti non ionici
alte concentrazioni saline promuovono interazioni tra zone idrofobiche superficiali in proteine, favorendone la
precipitazione. se si arriva a concentrazioni saline appena al di sotto del punto di precipitazione, in soluzioni
proteiche diluite, in presenza di matrici debolmente idrofobiche immobilizzate, si può promuovere il legame di
proteine ad una matrice, invece di farle precipitare. in queste condizioni, le proteine mantengono la loro
conformazione nativa (attività biologica). ci si avvantaggia di questo fenomemo per adsorbire proteine a
colonne di HIC ad alte concentrazioni saline e desorbirle selettivamente facendo diminuire la forza ionica
dell'eluente nel tampone di eluzione.
l'adsorbimento per varie proteine aumenta con l'idrofobicità del tipo di ligando (da metil a pentil a -OH-propil
essendo il più idrofilo). con proteine non ancora caratterizzate è bene partire con una matrice fenil-sostituita, in
quanto proteine fortemente idrofobiche potrebbero non essere eluite facilmente da una resina pentil-sostituita.
meccanismo HIC
in prossimità della superficie di ligando e soluto idrofobici, le molecole d'acqua sono più ordinate che nella
massa liquida e fungono da schermo alle aree idrofobiche. il sale aggiunto in soluzione sequestra le molecole di
H2O diminnuendo la schermatura e quindi liberando la forza trainante che spige all'interazione tra soluto e
ligando. in HIC, il caricamento di proteina sulla resina avviene sempre ad alta molarità di sali
esistono diversi tipi di ligandi usati in resine HIC. la Pharmacia attacca covalentemente questi ligandi ad una
matrice di agarosio ad alta densità e cross-legato (sepharose-CL) che è stabile in presenza di alte concentrazioni
saline (normalmente l'agarosio è tenuto insieme da legami a idrogeno). il fenil-sepharose si è rivelato utile anche
con proteine di membrana perchè mantiene la sua capacità di ligando idrofobico anche in presenza di surfattanti
(necessari per disgregare la membrana delle proteine)
differenze tra HIC e RPC
entrambe basate su interazioni tra gruppi non polari (zone idrofobiche) accessibili al solvente, sulla superficie di
biomolecole e ligandi idrofobici (gruppi alchilici o arilici) attaccati covalentemente ad una matrice.
-gli adsorbenti per RPC sono più altamente sostituiti rispetto a quelli per HIC
-in HIC il grado di sostituzione è dell'ordine di 10-50microM/mL di gel di C2-C8 alchil o ligandi alchilici
semplici, paragonato a centinaia di microM/mL di gel di ligandi C4-C18 usati in resine per RPC. perciò
l'interazione di adsorbenti RPC con proteine è molto forte, il che richiede solventi non polari per la loro
eluizione, con conseguente denaturazione. in HIC l'interazione è più blanda e si mantiene la struttura nativa
-i gradienti di eluzione in RPC sono delle rampe di solvente organico in salita mentre in HIC sono delle rampe
saline in discesa
Hofmeister osservò che vari ioni inorganici possono essere sistemati secondo un ordine che permette di
prevedere la loro efficacia nel "salting-out" (precipitazione) di una gran quantità di proteine. questa particolare
sequenza è la conseguenza di caratteristiche proprie dei singoli ioni, come le dimensioni, l'idratazione e la
carica. l'effetto opposto (caotropico) si chiama "salting-in". questi sali possono anche essere ordinati in base alla
loro influenza positiva nell'aumentare la tensione superficiale molale dell'acqua. in entrambi i casi i solfati di
Na, K o ammonio producono effetti più elevati di salting-out o di incrementi di tensioni superficiale di acqua.
sono anche i sali migliori nel promuovere l'effetto di adsorbimento di HIC
non è facile prevedere l'effetto del pH su HIC
solventi usati in HIC: acqua etilene glycon, dimetil sulphoxide, dimetil formamide, n-propanolo
basse concentrazioni di alcools miscibili con H2O, surfattanti e soluzioni acquose di sali caotropici
indeboliscono l'interazione di proteine con i ligandi in HIC, portando al loro desorbimento. la parte non polare
di alcools e surfattanti compete con efficacia con le proteine legate per i siti di adsorbimento in resine per HIC,
spiazzandole dalle sferette di adsorbente. i sali caotropici alterano la struttura ordinata dell'acqua e quella delle
proteine legate. entrambi gli additivi diminuiscono la tensione superficiale dell'acqua: il risultato è un
indebolimento delle interazioni idrofobiche ed una dissociazione del complesso ligando (resina)-proteina
la cromatografia di affinità si basa sul principio che un ligando, fissato covalentemente ad una matrice (supporto
cromatografico, in genere agarosio) si complessi ad una molecola "bersaglio" in una miscela eterogenea da
analizzare. in condizioni ideali, tale ligando riconosce una sola molecola, adsorbendola e lasciando fluire tutte le
altre proteine dalla colonna (wash). la macromolecola legata può essere eluita (desorption) dalla colonna con un
eluente che contenga, in fase libera lo stesso ligando fissato sulla colonna (oppure cambiando il pH o
abbassando la costante di associazione ligando/molecola bersaglio). questo permette un recupero della molecola
di interesse in condizioni di altissima purificazione o quasi omogenea
il sito attivo di una macromolecola di solito è situato in profondità nella struttura tridimensionale, quindi non è
facilmente accessibile a piccoli ligandi fissati covalentemente ad una matrice inerte come l'agarosio. in questi
casi le resine d'affinità mostrano scarsa capacità di legame e quindi bassissima efficienza. è prassi comune, in
cromatografia d'affinità, interporre un "braccio spaziatore" tra resina e ligando. la lunghezza di tale braccio è
piuttosto critica: se troppo corto può essere poco efficace, se troppo lungo può portare ad effetto idrofobico e
quindi ripiegare su se stesso annullando la spaziatura
il materiale di partenza è in genere il CNBr-Activated Sepharose 4B (Seph) che di solito si fa reagire con un
braccio spaziatore a sei atomi che termina con un gruppo carbossilico (-CH) o con un gruppo amminico (-AH).
il Seph-AH è la matrice più reattiva
una classe molto importante di ligandi per la purificazione di glicoproteine è la classe delle lettine, proteine
vegetali e animali che hanno fortissima affinità per alcuni tipi di zuccheri presenti nella catena oligosaccaridica
delle glicoproteine. queste vengono legate a resine di agarosio e vengono vendute, già pronte per l'uso, per la
cattura e purificazione di numerose glicoproteine dai più svariati tessuti e liquidi biologici. la "lectin affinity
chromatography" è estremamente importante nell'analisi proteomica.
procedura IGOT (isotope coded glycosylation-site-specific tagging) e spettrometria di massa dei peptidi ottenuti
-set di glicoproteine isolate da miscele complesse tramite LAC. dopo digestione triptica delle proteine, i
glicopeptidi vengono catturati nuovamente con LAC e poi trattati con l'enzima PNGasi in H2(^18O), per
rimuovere la catena zuccherina ed incorporare un marcatore specifico del sito di glicosilazione (^18O). i peptidi
sono poi analizzati tramite LC-MS/MS.
We describe here a strategy for the large-scale identification of N-glycosylated proteins from a complex
biological sample. The approach, termed isotope-coded glycosylation-site-specific tagging (IGOT), is based on
the lectin column–mediated affinity capture of a set of glycopeptides generated by tryptic digestion of protein
mixtures, followed by peptide-N-glycosidase–mediated incorporation of a stable isotope tag, 18O, specifically
into the N-glycosylation site. The 18O-tagged peptides are then identified by multi-dimensional liquid
chromatography–mass spectrometry (LC-MS)-based technology. The application of this method to the
characterization of N-linked high-mannose and/or hybrid-type glycoproteins from an extract ofCaenorhabditis
elegans proteins allowed the identification of 250 glycoproteins, including 83 putative transmembrane proteins,
with the simultaneous determination of 400 unique N-glycosylation sites. Because the method is applicable to
the systematic identification of a wide range of glycoproteins, it should facilitate basic glycobiology research
and may be useful for diagnostic applications, such as genome-wide screening for disease-related glycoproteins.
una matrice molto usata è quella per "immuno-affinity chromatography" (IAC). in questo caso è l'anticorpo
stesso (una macromolecola) che viene legato alla resina e serve a catturare un antigene. per IAC si usa o la serie
di Affi-Gel che sono agarosi cross-legati con un braccio spaziatore di 10 o 15 atomi di C, oppure Sepharose
attivato con bromuro di cianogeno (CNBr). l'anticorpo viene quindi legato alla resina tramite i gruppi aminici
teminali.
La resina per cromatografia covalente a scambio tiolico è la TDCC. sono disponibili commercialmente due tipi
di resine tiolate, su supporto di matrice agarosica:
- thiol-sepharose 4B (contiene 1 microM di gruppi 2-piridil disolfuro per mL di resina con una capacità di 2-3
mg proteina per mL di gel, il braccio spaziatore, il glutatione, ha una doppia carica negativa)
- tiopropil-sepharose 6B (contiene ca 20microM di 2-piridil disolfuro per mL di gel con una capacità di ca 1214mg proteina per mL di gel, lo spaziatore, il gruppo idrossi-propile, è neutro)
Esistono delle varianti di utilizzo della TDCC tramite l'uso di scambio di disolfuri tiolici
1) versione generale: un gel disolfuro viene usato a pH 8.0 per isolare ogni tipo di molecola tiolata
2) protonazione del gruppo tiolico della resina a pH 4.0 per l'isolamento selettivo di molecole contenti gruppi
tiolici a basso valore di pK.
Quando la resina lega la proteina, libera uno ioni tiolato. Quest'ultimo assorbe fortemente a 343nm. Alla fine del
processo di purificazione, la proteina specifica legata covalentemente alla resina, viene liberata lavando il gel
con un composto tiolato. La resina viene poi rigenerata.
3) si può anche usare una proteina il cui gruppo -SH viene attivato con lo stesso reattivo dei metodi precedenti
(il 2-Py-S-S-2-Py) ed invece il gel di cattura esibisce lo ione tiolato ridotto. La proteina viene catturata dal gel
formando un disolfuro misto. Dopo lavaggio, la proteina viene eluita con un riducente di disolfuri misti.
può anche essere possibile che, in seguito all'adsorbimento di diverse proteine tiolate, queste si possano eluire
sequenzialmente usando tre composti tiolici a bassa massa molecolare a forza riducente progressivamente
crescente oppure usati a concentrazioni progressivamente crescenti
per la "proteine ligand affinity chromatography" come gels si usano AffiGel 10 (braccio spaziatore da 10 atomi)
e AffiGel 15 (da 15 atomi). entrambi i gels sono agarosi cross-legati derivatizzati con un estere di Nidrossisuccinimide per attivarne il carbossile all'estremità della catena. Quando la proteina viene incubata col
gel, il suo gruppo NH2 libero forma un legame covalente con la matrice di gel. La reazione può essere condotta
tra pH 6.5 e 10
I coloranti triazinici sono usati in precipitazione di affinità, in processi di ripartizione in due fasi acquose di
polimeri e in cromatografia a letto espanso.
per la cell affinity chromatography (CAC) non si può usare come supporto il Sepharose 6B perchè le sferette
hanno dimensione media di ca 100 microm. si usano macrosfere di Sepharose 6B di dimensione media di
300microm. in tal modo le cellule catturate possono percolare tra le sferette, in eluzione, senza il rischio di
intrappolamento.
struttura dei gels di agarosio
lungo polimero naturale prodotto in alghe marine e purificato tramite processi di desulfatazione e
decarbosillazione che lo rendono pressochè neutro. formato da un alternarsi di D-galattosio e di 3-6 anidro Lgalattosio. viene sciolto in H2O all'ebollizione e lasciato raffreddare lentamente. al di sotto di 40°C comincia a
formare prima doppie eliche, cui fa seguito aggregazione laterale in pilastri di 7-11 doppie eliche. questo
conferisce forte rigidità e grandissima porosità. per essere reso insolubile al calore e a solventi organici (che
rompono i legami ad idrogeno che ne formano la struttura) può essere cross-legato.
accoppiamento di ligandi biospecifici alla matrice agarosica
la matrice va attivata, in genere con bromuro di cianogeno (CNBr). poichè tale reattivo è altamente tossico
(come pure i suoi prodotti di degradazione, acido cianidrico e acido bromidrico) di solito l'attivazione viene
eseguita dalla ditta che lo commercializza. i gruppi reattivi, imidocarbonato o esteri di cianato, che si formano
sul polimero di agarosio, possono essere fatti reagire con un ligando che contenga un gruppo -NH2. a questo
punto la resina è pronta per la cattura
il frammento antigen-binding (Fab) è ottenuto per digestione con papaina di IgG (immunoglobuline G). tale
frammento è di >25000Da. anticorpi anti-Fab possono essere legati ad una resina ed usati per purificare cellule
linfocitarie del tipo T (timo) e B (bursa) da linfonodi di animali. in questo caso la miscela di linfociti T e B è
applicata alla colonna. le T non vengono trattenute (non-adsorbed cell fraction). quando la colonna è lavata con
IgG libere si recuperano le cellule B (>85% purezza).
questo tipo di separazione può anche essere utilizzato a cascata.
le lettine immobilizzate offrono una valida alternativa agli immunoassorbenti per la purificazione di sottopopolazioni cellulari specifiche.
CROMATOGRAFIA SU IDROSSIAPATITE (HAP)
già nel 1956 Tiselius aveva mostrato che quando la brusite [Ca3(PO4)2] veniva convertita in idrossiapatite
(HAP) [Ca5(PO4)3OH] per ebollizione in 1% NaOH per 1 ora, si otteneva un forte adsorbente di proteine. HAP
si lega tenacemente le proteine allo stato nativo, molto più debolmente le proteine denaturate. anche se HAP
lega sia proteine acide che basiche, non è semplice chiarire il meccanismo di adsorbimento ed il comportamento
cromatografico. la struttura di superficie di cristalli di HAP è un mosaico di cariche positive (Ca++) e negative
(ioni fosfato). l'adsorbimento di composti anionici avviene sui domini carichi positivamente (siti C) mentre i siti
a forte carica negativa (siti P) possono essere considerati come scambiatori cationici. pertanto la matrice HAP
può essere considerata un tipo di cromatografia a scambio ionico in modalità mista. il meccanismo di legame
sembra essere tra carbossili proteici e Ca++ da un lato, e dall'altro l'attrazione non specifica tra gruppi amminici
positivi e cariche negative dei fosfati. a pH 6.8, cioè al pH operativo preferenziale di questo tipo di matrice, la
superficie di HAP è prevalentemente tappezzata di cariche negative a causa della neutralizzazione parziale delle
cariche di Ca++. pertanto l'eluzione può avvenire o tramite una schermatura non specifica delle cariche da parte
di sali (effetto di schermatura di Debye-Huckel) oppure per spiazzamento specifico dei gruppi proteici dai siti C
della colonna, cui le proteine si sono complessate
le colonne di HAP mostrano forte affinità per proteine basiche con alti pI. questo perchè la HAP è composta da
gruppi di cariche positive (ioni Ca++) sparsi tra gruppi di cariche negative (gruppi fosfato). a pH neutro le
cariche negative sul carrier HAP prevalgono
poichè i cristalli di idrossiapatite sono piuttosto fragili, e non sopportano alte pressioni, le moderne varianti sono
costituite da sferette di ceramica rivestite di cristalli di fluoroapatite (FAP), ottenuta da HAP tramite lavaggio
della colonna con un tampone contenente fluoruri. la FAP è più stabile e meno solubile in un ambiente acido
della HAP. HA-Ultrogel (della Biosepra) è costituita da microcristalli di HAP inglobati in matrice agarosica.
per quanto la matrice di HAP mostri alta affinità per proteine basiche ad elevato pI e bassa affinità per proteine
acide a basso pI, il comportamento in eluzione dalla colonna può essere modulato da una scelta opportuna del
sale nell'eluente.
in cromatografia a scambio ionico il gradiente di pH è formato all'esterno della colonna, tramite un gradientatore
bicamere contenente due soluzioni titolanti agli estremi del pH desiderato
in chromatofocusing il gradiente di pH è generato internamente, mano a mano che il tampone di eluzione titola i
gruppi funzionali della matrice usata in CF. naturalmente bisogna che la matrice non contenga un singolo
gruppo titolante ma una serie di gruppi con pK diversi su un certo intervallo di pH. anche l'eluente non può
essere un tampone semplice, ma sarà infatti una miscela di tamponi che copre lo stesso intervallo di pH che si
vuole generare
formazione di un gradiente di pH 9-6 in una colonna di PBE 94 eluita con Polybuffer 96. all'inizio PBE 94 è
titolata al pH di partenza 9.0 mentre l'eluente (limit buffer) è titolato al pH finale 6.0. lo scambiatore PBE 94 è
probabilmente ottenuto accoppiando a Sepharose 6B delle oligoamine che , grazie ai loro valori di pH ben
distribuiti tra 4 e 9 assicurano un potere tampone uniforme nello stesso intervallo di pH. l'eluente Polybuffer 96
è in realtà una miscela di anfoliti trasportatori in grado di tamponare uniformemente nell'intervallo di pH 6-9
Vestberg è stato il padre della isoelettrofocalizzazione (IEF) con la brillante sintesi degli anfoliti trasportatori
(CA), la moltitudine di tamponi in grado di creare e mantenere un gradiente di pH nel campo elettrico durante il
processo di IEF. vestberg aveva misurato i valori di pK di una serie di oligoamine (TETA, TEPA, PEHA) ed
aveva visto che questi valori si distribuiscono abbastanza regolarmente lungo la scala di pH. una miscela
opportuna di tali oligoamine assicura un potere tampone piuttosto uniforme nell'intervallo pH 9.5-6.0. inoltre le
oligoamine contenenti >4 gruppi amminici hanno catene ramificate, il che contribuisce ad una maggiore
dispersione dei valori di pK. Sono probabilmente miscele opportune di questi composti che costituiscono la base
dei gruppi di scambio delle resine per chromatofocusing
in CF il pH cresce verso l'uscita della colonna. le molecole proteiche che si trovano al di sopra del loro valore di
pI si caricano negativamente e si legano alla colonna. la proteina rimane legata fino a che il gradiente di pH che
si sta sviluppando la titola al di sotto del suo valore di pH. a questo punto la proteina viene repulsa dal gel fino a
che il gradiente di pH la rititola al di sotto del suo pI, per cui si lega di nuovo. questo processo si ripete di
continuo lungo il cammino verso il fondo della colonna, facendo si che le proteine vengano eluite a valori di pH
quasi uguali al loro pI. le molecole al loro pI non sono nè legate ne repulse
effetto di focalizzazione in CF. le molecole proteiche alla fine di una zona sono respinte dal gel e migrano più
rapidamente delle proteine sul fronte della zona stessa. se una seconda aliquota della stessa proteina è applicata
alla colonna dopo la prima, raggiungerà rapidamente la prima zona e co-eluirà con la prima. se un secondo
campione di una diversa proteina, con un pI più alto, viene applicato, sorpasserà la zona della proteina al pI più
basso e verrà eluito in fronte
CF permette la separazione di quantità elevate di proteine ad alta risoluzione (piccolo delta pI). in linea di
principio, qualsiasi macromolecola anfotera, con valori di pI tra 3 e 10 può essere separata. CF è pertanto una
metodica ideale per separare proteine e peptidi
oltre alle resine classiche, supportate da una matrice agarosica (sepharose) esistono anche due tipi di resina
supportati da una matrice di polistirene divinilbenzane. questa matrice è usata come supporto per la
Hydrophobic interaction chromatography, essendo una resina molto idrofobica. il fatto che sia ricoperta da
gruppi di scambio amminici terziari e quaternari fa si che sia idrofila. il vantaggio di questo tipo di supporto è
che le sferette sono rigide e possono essere operate a pressione più elevate. inoltre, a causa del processo di
sintesi, si possono ottenere sferette molto uniformi e perfettamente sferiche
in parecchie ricette di tamponi di eluzione compaiono i Pharmalytes che sono anfoliti trasportatori usati per
l'isoelettrofocalizzazione in metodiche elettroforetiche. anche i vari intervalli di Polybuffers non sono che
preparazioni grezze di questi anfoliti trasportatori (acidi oligoamino oligocarbossilici)
il potere tampone è costante nell'intervallo di titolazione
i polybuffer, come prevedibile in base alla loro struttura (acidi alifatici oligoamino olicocarbossilici), hanno
assorbanza a 280 nm che è negligibile, il che permette di monitorare le colonne di chromatofocusing, in
eluzione, tramite cella a flusso UV a 280nm, dove esiste un picco tipico di assorbanza delle proteine, dovuto alla
presenza dei due amino acidi aromatici Tyr e Trp
1937 Tiselius mette a punto il moving boundary che segna un punto di rivoluzione nella scienza di separazione.
lo strumento di Tiselius permette per la prima volta la misurazione accurata alla mobilità assoluta delle proteine.
principi di investigazione: un leggero piano sul percorso di migrazione permette di determinare il limite di
movimento
quando questi limiti vengono visualizzati come transizioni sigmoidali, un complesso strumento ottico li
trasforma in picchi, facimente ricoducibili a trattamenti computazionali
μ=(Zq)/(6πηr_s)
M=(R'TS)/[D(1-vsegnato*ρ)
S=(1/ω^2*r)(dr/dt)=(1/ω^2)(d ln r /dt)
Z=frazione molare di carica proteica
q= carica dell'elettrone (1,60*10^(-19) coulomb)
η= viscosità del solvente
r_s= raggio di Stokes
μ=mobilità elettroforetica (m^2/V*s)
T= temperatura assoluta
S=coefficiente di sedimentazione
D=coefficiente di diffusione
ρ=densità del solvente
v=volume specifico parziale della proteina
M=massa molecolare
R=costante dei gas
l'importanza dell'appartato di Tiselius: uno può determinare la mobilità libera e da questa, la superficie di carica
di una proteina. principalmente l'equazione della mu dà il rapporto tra la carica netta di superficie (il prodotto di
Z * q)a il raggio della particella, che può essere calcolato sapendo la massa. l'equazione di Svedberg rende
possibile la determinazione di una massa precisa, attraverso una precisa misurazione di S e D (conoscendo v e
ro). così si può derivare la curva di titolazione di una proteina
l'elettroforesi a zone (ZE)
nella ZE, lo ione analita è completamente separato dagli altri. al contrario in Tiselius moving boundary (MBE),
solo la testa e la coda rappresentano zone pulite, lo spazio in mezzo è pieno di un mix di tutti i differenti ioni
della preparazione. da quando una zona di macromolecole pure, se circondata da buffer libero, sedimenta nel
campo gravitazionale sul fondo della camera, MBE non potrà mai essere ricondotto a un ZE indipendentemente
dalla durata dell'esperimento. invece ZE, da quando fisicamente separa le zone tra di loro, necessita di un
medium di supporto, che agisca come mezzo antigravitazionale, impedendo alle zone di sedimentare. un
esempio (il peggiore) di questi primi supporti era un foglio di carta filtro. convenzionalmente ZE è eseguita a
pH del buffer costante
la ZE con carta filtro fu usata per primo da Klobusitzky e koning per isolare il pigmento giallo dal veleno di
serpente. l'elettroforesi di carta fu presto abbandonata per la separazione di proteine in quanto il suo contenuto di
carbossili agisce come centro di scambio ionico rovinando la separazione. Ma fu largamente usata negli anni 50
e 60 per l'elettroforesi di piccoli ioni nella sua variante di elettroforesi ad alto voltaggio. a questo scopo i fogli
erano immersi in un bagno di tetracloruro di carbonio che agiva come una fonte di calore e preveniva
l'evaporazione della miscela dalla carta da filtro. Da notare anche come i compartimenti degli elettrodi erano
fisicamente separati dalla vasca di elettroforesi per evitare contaminazioni tra gli ioni di elettrolisi e
l'ossidazione/riduzione prodotta dagli elettrodi
un ulteriore evoluzione dell'elettroforesi con carta fu la tecnica bidimensionale sviluppata per la prima volta da
Vernon Ingram nel 58 per l'identificazione di punti di mutazioni nella digestione triptica delle proteine.
EVOLUZIONE FINO ALL'ELETTROFORESI
DISC-ELETTROFORESI
polyacrylamide fu la prima matrice totalmente trasparente, completamente neutra, capace di essere utilizzata in
una varietà di formulazioni grazie a un'ampia gamma di porosità. il concetto di isotacoforesi fu esplorato per la
prima volta, per organizzare una gamma di ioni proteici con Cl- come testa e glycinate come ione terminale.
all'inizio lo ione leading (Cl-) è posto in tutte le tre parti di gel mentre gli ioni trailing sono presenti solo nelle
soluzioni buffer delle riserve di elettrodi. a determinato pH (6.7), la mobilità dello ione terminale (Gly-) è la più
bassa (quasi isoelettrico). all'interfaccia leading/trailing sarà presente un altissimo gradiente, che accelera le
proteine e gli ioni trailing così tanto che essi migrano dietro lo ione leading alla stessa velocità e di conseguenza
si impilano secondo la funzione di autoregolazione di Kohlrausch. quando la mobilità delle proteine è
intermedia tra leading e trailing si radunano in sezioni mobili e si impilano in zone altamente concentrate.
proteine individuali formano una disposizione sequenziale, impilate in dischi di microspessore ordinate secondo
la loro mobilità (pI) e situate tra il leading e il traiding ions
in principio, nella disc elettroforesi, non è possibile discriminare tra carica superficiale e massa di una proteina,
come invece si può fare in SDS-PAGE e IEF, perchè nel gel di separazione ogni macromolecola migrerà
secondo entrambi i parametri. tuttavia, eseguendo una serie di esperimenti in serie di gel di differenti porosità
(%T), è possibile discriminare tra i due contributi costruendo un grafico (Ferguson plot) che obbedisce alla
seguente relazione: log m = log m0 - KT, dove m0 è la mobilità libera (a 0% di densità del gel) e K è il
coefficiente di ritardo ed è proporzionale alla massa della particella.
secondo il Ferguson plots, la pendenza del log della mobilità vs %T (porosità) è proporzionale alla dimensione
della molecola e le intersezioni delle ordinate di queste linee sono proporzionali alla mobilità libera m0. è qui
ricordato che m0=Q/(6*pgreco*mu*r) dove Q è la carica netta superficiale, mu la viscosità della soluzione e r è
il raggio della macromolecola. di conseguenza, due curve parallele indicano l'occorrenza di proteine di taglia
indentica ma differente carica superficiale mentre due linee non parallele (che si intersecano quindi) indicano
proteine che differiscono sia in dimensione che in carica e sono quindi totalmente incorrelate. attualmente i
grafici Ferguson non sono più molto in voga grazie all'SDS-PAGE e all'IEF
nella PAGE tradizionale la migrazione di una proteina in un mezzo di setacciamento come un gel di
poliacrilamide non è solo una funzione di carica e massa ma anche di forma. date due proteine aventi la stessa
carica superficiale e la stessa massa, la loro separazione può essere ottenuta se le due hanno differente forma
l'avvento dei gels di poliacrilamide aprì una nuova era nelle metodologie elettrocinetiche. per la prima volta, noi
abbiamo una matrice completamente trasparente (perfino l'agarosio non è completamente limpido alla
concentrazione necessaria per la separazione), privo di carica (contrariamente all'agar e all'amido che
contengono quantità rilevabili di cariche negative) e capace di essere polimerizzato in pori di diversa forma e
dimensione per permettere proprietà di setacciamento uniche. perfino adesso i gel di poliacrilamide sono le
matrici di elezione nella maggior parte delle tecniche elettroforetiche per proteine e acidi nucleici di piccole
dimensioni. in aggiunta, soluzioni viscose di poliacrilamide (privi di cross-linker) sono estensivamente usate in
capillari di zone elettroforesi come matrice sostituibile chiamata "polimeri liquidi setaccianti"
la tipica struttura di un gel di poliacrilamide è ottenuta dal monomero di acrilamide e dal co-monomero (agente
di cross-linking) N,N'-methylene-bis-acrilamide. la formulazione tipica del gel è da un minimo del 3% totale di
monomeri (%T) fino al 60%T mentre quella del cross-linker (%C) è di solito tra 2% e 8%C. , in ogni caso si può
vedere che gel con %C del 50% si possono costruire ma sono opachi e troppo idrofobici, tanto da escludere
l'acqua e collassare. nella maggior parte delle formulazioni la %T varia da 4 a 30 %T (per setacciare proteine
particolarmente piccole) mentre %C è di solito tenuta sul 4%. nessuna gelificazione è presente al di sotto del
2%T e 0.5%C
anche se il gel di poliacrilamide può essere una matrice veramente neutrale, questo non è quasi mai il caso.
infatti, durante la polimerizzazione, 3 eventi possono occorrere e portare a 3 differenti casi:
-alla fine delle catena, il TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylendiamine) può essere incorporato, dando come
risultato una carica positiva
-un residuo del catalizzatore persolfato può essere incorporato, dando un gruppo terminale con una carica
negativa
-solo nel caso di incorporazione di un gruppo -OH, la catena terminale sarà neutrale
un modo semplice ed efficiente di variare la dimensione dei pori è di formare un gel con l'aiuto di un mixer di
gradiente così da risultare un gradiente di poliacrilamide lungo il percorso di migrazione. questo gradiente ha
anche il vantaggio di ridurre le bande incrementando la risoluzione. originalmente, i gradienti erano
esponenzialmente concavi, adesso vengono usati in alcuni casi anche gradienti convessi.
1967: Shapiro, Vinuela, Maizel escono con la nozione del cammuffamento: se si lascia nuotare le proteine in
una soluzione di tensioattivi (surfactant) anionici, al di sopra della contrazione critica micellare (sodio dodecil
solfato SDS) esse saranno sicuramente rivestite da micelle di questa composizione chimica, al punto di coprire
l'originale carica anfotera delle catene polipeptidiche e forzandole a comportarsi come acidi nucleici, particolari
macromolecole in cui il rapporto carica/massa è quasi costante sopra i 400bp in lunghezza. la maggior parte
delle proteine assorbono SDS per il rapporto magico di 1.4ms SDS/mg di proteina. //manca frase
posso avere micelle N-terminali, M (middle) e C-terminali. in saturazione i complessi di micelle sono connessi
da linkers oligopeptidici flessibili di 5 o 6 di residui di amino acidi; diminuendo la concentrazione di SDS al di
sotto del livello di sub-saturazione, le piccole micelle N si fondono con le M e le micelle C si avvicinano alle M.
le micelle hanno un cuore idrofobico e un guscio esterno idrofilico, quest'ultimo è formato da allungamenti di
catene polipeptidiche e dai gruppi fosfato del SDS
le glicoproteine spesso mostrano una migrazione anormale durante l'SDS-PAGE, dato da differenti valori di Mr
quando determinano differenti concentrazioni del gel. ciò è causato dalla loro porzione idrofilica glicana che
riduce le interazioni idrofobiche tra la proteina e la SDS, impedendo i collegamenti della SDS nella giusta
proporzione. una più accurata procedura sembra essere l'uso di un gel SDS gradientato
le analisi della viscosità suggeriscono riducono i complessi polipeptidi-SDS per particelle ad asta, con
lunghezze proporzionali alla massa molecolare della catena polipeptidica. polipeptidi non ridotti contengono
intatti ponti disolfuro non adatti all'ottimale quantità di SDS e hanno differenti volumi idrodinamici. SDS lega
prevalentemente con le regioni idrofobiche dei polipeptidi. benchè ORD (optical rotatory dispersion) suggerisce
ancora significanti porzioni di strutture ad alfa-elica, è suggerito che la conformazione totale si avvicina più ad
una bobina casuale che ad un'asta
TBP (tributylphosphine) ha due principali vantaggi:
-la reazione è stechiometrica, il che significa che 1-2 mM sono più che abbastanza per la riduzione
-essendo neutrale, non migra nei campi elettrici, così se un IEF gel si rigonfia in TBP, la sua distribuzione nel
gel sarà costante durante la corsa IEF, contrariamente alla DTT e beta-ME, che saranno vuotati nella regione
alcalina del gel e raccolti alla neutralità (pH7)
dato che a migrazione di un complesso proteico-SDS in una matrice gel è soprattutto determinato dalla sua
dimensione, non sorprende che un'ulteriore frazionamento può essere ottenuto sui gel di porosità graduata. in
questi gradienti la velocità di migrazione di una banda è inversamente proporzionale al tempo e varia
esponenzialmente con la distanza percorsa. sperimentalmente è stato trovato che dopo un tempo sufficiente un
percorso stabile si sviluppa, in cui i diversi componenti continuano a muoversi lentamente ma le loro posizioni
relative rimangono costanti.
come nei sistemi senza detergenti, l'uso di buffer multifasici in SDS-PAGE ,porta bande più strette e migliore
risoluzione, quindi è quasi universalmente usato oggigiorno. è importante richiamare che la natura
dell'impilamento è in qualche modo alterata in presenza di SDS, dopo le proteine SDS-rivestite hanno un
rapporto carica/massa costante. di conseguenza, migreranno con la stessa mobilità e si impileranno
automaticamente. inoltre, siccome la carica netta della proteina-SDS micellare non varia nell'intervallo di pH 710, la mobilità non è influenzata in questo range di pH. un eccellente sistema è utilizzare un buffer
tricina/acetato, in cui la tricina è usata come terminatore al posto della glicina. questo metodo porta ad una
risoluzione lineare da 1 a 100 kDa
SDS-PAGE è un metodo eccellente non solo per determinare la purezza di una preparazione proteica, ma anche
per una rapida valutazione dell'approssimazione dell'Mr di una catena polipeptidica. per questo, una semplice
relazione semi-logaritmica può essere stabilita, da cui il logaritmo della massa molecolare una serie di markers
noti è tracciata sulla mobilità relativa. il grafico è in generale lineare in un dato intervallo di valori di Mr, e per
un dato gel %T costante. agli estremi, per troppo grandi o troppo piccole proteine, il tracciato non è lineare e
altre soluzioni devono essere usate, come l'uso di gradienti di porosità
in un gel %T costante, la relazione semilogaritmica per determinare Mr non è così accurata e non copre un
grande intervallo di valori di Mr. migliori risultati si ottengono usando un gel con porosità gradientata, che
estende linearmente il range almeno a 100kDa e offre range di calibrazione molto più riproducibili e lineari.
campioni proteici sono separati da SDS-PAGE e tinti con Coomassie brilliant blue R-250
le bande contenenti le proteine di interesse sono tagliate dal gel, equilibrate e posizionate su un secondo
gel insieme ad una proteasi adatta
le proteine e le proteasi sono fatte correre sul gel e i peptidi risultanti sono visualizzate ad esempio con il
silver staining
L'SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, ossia elettroforesi su gel di
poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato) è una tecnica analitica che permette l'analisi di estratti
proteici. Il principio su cui si basa questa tecnica elettroforetica è l'attività denaturante dell'SDS; questo è in
grado di interagire con le proteine in un rapporto costante di 1,4 g di SDS ogni grammo di proteina. La
separazione avviene quindi per differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa carica per ogni
proteina denaturata con SDS rimane costante.
bilanciamento elettroforetico e trasportatori di massa diffusionale:
c mu i / q K = D(dC / c x)
c= concentrazione di un componente
mu = mobilità elettroforetica (cm^2* V^(-1)*s^(-1))
i = corrente elettrica (A)
q = area della sezione trasversale (cm^2)
k= mezzo di conduzione (ohm^(-1)* cm^(-1))
D = coefficiente di diffusione (cm^2*s^(-1))
x = distanza di separazione
dalla prima equazione si può ricavare:
(i mu / q)(dx/k) = D(dC / C)
stato stazionario, soluzione analitica
distribuzione di concentrazione gaussiana con punti di flesso
c = c0 exp [-(p i x^2)/(2 q k D), dove x=0 alla concentrazione massima c0
punti di flesso a xi=+-\/(qkD)/(pi), dove p = -du/dx=-[du/d(pH)][d(pH)/dx]
la curva rappresenta la forza che agiste su una zona condensata in IEF. la zona focalizzata è rappresentata come
un picco gaussiano simmetrico sul suo punto di focalizzazione (pI; y=0). la migrazione del campione sulle
posizioni di pI è guidato dal gradiente di tensione e dalla pendenza del gradiente di pH (σ è la deviazione
standard del picco)
un ambiente chimico è generato con proprietà ambientali descritte dal parametro p'' che cambia da punto a punto
lungo l'asse z (p''=ɸz). particelle caratterizzate dal valore p' del parametro, corrispondono al parametro p'' della
sospensione fluida, disperso con una distribuzione arbitraria nella colonna di liquido. è ipotizzato che esiste un
punto in cui il gradiente della distribuzione p'' corrisponde a p'=p'', dove il parametro della particella equivale ai
parametri ambientali
effetto focusing
lo stesso ione proteico (B, pI=8.0) è applicato ad una lastra di gel pre-focalizzato vicino al catodo (zona a carica
negativa) e vicino all'anodo (positiva). i due fronti proteici migreranno incontro l'uno all'altro e si
condenseranno, o focalizzeranno, in una singola zona di carica zero e mobilità zero
un profilo veramente gaussiano sulla lunghezza della colonna può essere ottenuto solamente lungo la neutralità
il marchio di qualità di un buon anfolita trasportatore è il suo potere di buffering (β) a pH=pI
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
principi di isotacoforesi (ITP)
ITP viene utilizzata quando ioni campione sono in mezzo tra uno ione veloce (trainante) e uno ione lento
(terminale) separati da confini netti. questa configurazione obbedisce alla funzione di regolazione di
Kohlrausch: CA/CB = UA/(UA+UR) * (UB+UR)/UB * LA/LB, in cui U è la mobilità (cm^2 V^(-1) s^(-1)), L
è la carica elettrica e C è la concentrazione degli ioni carichi negativamente A- e B-. questa equazione da le
condizioni della soglia tra i due ioni, con uno ione in comune (R+, o contro-ione, di solito lo ione buffering)
quando la soglia migra in un campo elettrico. antecedentemente, ITP era chiamata in vari modi: medoto della
soglia mobile, elettroforesi di spostamento, cons elettroforesi...
meccanismo di separazione di due ioni in mezzo tra L- e T- (e aventi una mobilità intermedia).
ad un gradiente di mobilità, corrisponde, in ogni zona un ripido gradiente di tensione che accelera tutti gli ioni
lenti fino alla velocità dello ione leading
ad una molarità fissa del leading ion, tutti i sottoseguenti ioni devono adeguare la loro concentrazione a quella
del L-. ne consegue che se si aggiunge al sistema leading/terminator una concentrazione maggiore di ioni
campione, questi non possono concentrarsi oltre alla quantità fissata dalla funzione di Kohlrausch, ma la
lunghezza della loro zona deve aumentare. ne consegue che c'è una relazione lineare tra la quantità di campione
iniettato e la lunghezza della zona, che porta a un metodo semplice ed efficace di misurare la concentrazione dei
singoli ioni
uno degli unici due vantaggi dell'ITP è l'effetto di assottigliamento delle zone. questo è l'unico sistema in grado
di combattere la dissipazione dei picchi che comporterebbe la forza entropica. supponendo che il campione A- si
diffonda nella zona L-, si ritroverà una zona di più basso gradiente di tensione così che verrà decelerato fino a
tornare nella sua zona. al contrario se A- si diffonde nella zona T- si ritroverà in una zona con campo di forza
maggiore e sarà accelerato fino a tornare al suo posto. Questo particolare effetto non è presente nella ZE (zone
electrophresis), dove la dissipazione dei picchi avviene costantemente durante il processo. così in ZE sono
necessari brevi tempi di analisi per tenere concentrate le zone. in più la zona di applicazione deve essere il più
piccola possibile così da minimizzare la distribuzione dei picchi nel processo
l'altro vantaggio dell'ITP è l'effetto di concentrazione delle zone. se il componente A- è introdotto in una
concentrazione veramente bassa, la funzione di Kohlrausch verrà applicata anche su A- nonostante il suo
apporto sia impercettibile. dato che la mobilità di A- è compresa tra la mobilità di L- e T-, la concentrazione di
A- all'equilibrio sarà intermedia tra la concentrazione di L- e T-. questo è il risultato della concentrazione di Afino al raggiungimento del valore di concentrazione adatto. se un campione concentrato è introdotto nel sistema
ITP, sarà effettuato il procedimento contrario e verrà effettuata la diluizione dello stesso fino al valore
opportuno. questo particolare effetto di concentrazione è sfruttato nella disc elettroforesi e in SDS-PAGE
adottando sistemi disc così da concentrare effettivamente le proteine all'inizio del processo. dato che le proteine
hanno valori di Mr alti, la loro concentrazione iniziale sarà nell'ordine delle micromoli contrapposte ad esempio
a 10mM dell'elettrolita leading. questo significa che le proteine saranno concentrate, nella disc elettroforesi, da
un fattore alto 10000, un effetto di concentrazione incredibile che si avvia automaticamente nei primi minuti del
processo
nella separazione di diversi acidi organici e inorganici deboli, è importante selezionare il pH dell'elettrolita
leading così da ottimizzare e massimizzare la separazione di tutte le specie ioniche del campione. per una
separazione ottimale possono essere scelte condizioni acide (4) o alcaline (8.5). le condizioni peggiori per la
separazione sono quelle tra pH 6.0 e 7.0 dove diverse curve di titration si incrociano. al punto d'incrocio, i
differenti ioni migrano come un singolo picco.
nel 1983 Jorgenson & Lucas dimostrarono la potenza dell'elettroforesi zonale capillare (CZE) prendendo un
capillare di silice fuso, immergendo le sue estremità in piccole riserve elettrolitiche e connettendole all'alta
tensione (più di 30000V).
il formato delle lastre di gel è tipicamente da 5 a 25 cm di lunghezza, 5-25 cm di larghezza e 1-2mm di spessore.
il caricamento dei campioni avviene in un pozzetto prefabbricato nel gel.
in un capillare, il lume è tipicamente da 25 a 100 microm, il diametro esterno ca 375microm (incluso il
rivestimento plastico) e la lunghezza può superare il metro. dato che i capillari a foro stretto sono essi stessi
anticonvettivi, il gel non è essenziale. quindi CZE può essere eseguita in una soluzione libera (tubo aperto)
sebbene i polimeri liquidi setaccianti possono essere utilizzati per separazioni di dimensioni di DNA e proteine.
un meccanismo unico è operativo in CZE: il flusso elettroendoosmotico (EOF). questo è creato dal doppio strato
elettrico alle pareti di silice. i silanoli che ricoprono la sua superficie, aventi un pK medio di 5.5, sono
progressivamente ionizzati a valori di pH >3.0. dalla legge di elettroneutralità, uno strato di contro-ioni positivi
è forzato ad aderire ai silanoli negativi. questo è chiamato lo strato rigido, avendo uno spessore di uno strato di
ioni idratati. alla fine dello strato rigido, comincia lo strato diffuso, con un decadimento esponenziale di eccesso
di ioni positivi.. quest'ultimo strato può avere uno spessore da 1 a 10 nm in base alla forza ionica del buffer
quando una tensione è applicata al capillare, i cationi in eccesso nello strato diffuso agiscono come una pompa
osmotica, costringendo il liquido a scorrere verso il catodo. tranne alcuni nm vicini alle pareti di silice, il EOF
ha un profilo piatto, che previene la dispersione dei picchi e così aumenta particolarmente la risoluzione. al
contrario, nel flusso laminare, come quello prodotto da una pompa peristaltica, il fronte del liquido ha un profilo
parabolico che favorisce la dispersione dei picchi e il decremento della risoluzione. la pompa EOF, generata da
un gradiente di tensione in un lume carico, è utilizzata oggigiorno per muovere i liquidi in micro e nano canali,
in una moderna versione di CZE
c'è un unico vantaggio nella EOF: porta verso il catodo praticamente tutti i soluti, incluse le specie neutrali che
per definizione non dovrebbero muoversi in un campo elettrico. in presenza di un forte flusso EOF, perfino le
specie negative possono essere portate verso quella direzione, contro la "morale elettroforetica". gli ioni piccoli
si muovono più velocemente degli ioni più grandi.
inizialmente, non si poteva far molto per separare le specie neutrali in CZE dato che, al massimo, esse
migravano tutto come un picco singolo sul flusso EOF. fortunatamente, esiste la possibilità di usare micelle che
possono graduare fortemente la mobilità di tutti gli analiti neutrali. quando i surfatanti (tensioattivi) sono dissolti
al di sopra della loro concentrazione micellare critica (8-9 mM per SDS), si formano aggregazioni di molecole
surfattanti individuali. esse sono essenzialmente sferiche, con la coda idrofobica orientata al centro e la testa
carica orientata verso il buffer
tensioattivi anionici come SDS migrano verso l'anodo, che è in direzione opposta rispetto a EOF. dato che EOF
è generalmente più veloce che la velocità migratoria delle micelle a pH neutrali e alcalini, il movimento netto è
in direzione dell'OEF. durante la migrazione le micelle interagiranno col soluto in una modalità cromatografica
attraverso interazioni sia idrofobiche che elettrostatiche. per le specie neutrali, è solo la partizione dentro e fuori
le micelle che ha effetti sulla separazione. questo è il principio della "cromatografia elettrocinetica micellare"
(MEKC)
più il soluto interagisce con le micelle, più si allunga il tempo di migrazione, dato che le micelle si muovono
contro l'EOF. così, i composti più idrofobici interagiscono più fortemente con le micelle e sono trattenuti più a
lungo. la risoluzione è aumentata estendendo il range di eluizione o la finestra del tempo. nella separazione delle
specie neutrali, tutti i soluti sono eluiti tra t0 e tm (tempo micellare). i soluti idrofilici che non interagiscono
con le micelle eluiscono in EOF; quelli che sono totalmente trattenuti dalle micelle, eluiscono con le micelle. la
capacità dei picchi può quindi essere molto alta, grazie all'alta efficienza della MEKC. è quindi preferibile
utilizzare condizioni che aumentano il tempo di finestratura, che è dato da moderato EOF e micelle con alta
mobilità
piccole quantità di solventi organici (0-20% metanolo o acetonitrile) possono essere aggiunti al buffer. questa è
una pratica molto conosciuta in MEKC quando si ha a che fare con molecole piccole e utilizzata spesso per
aumentare la solubilità dell'analita. l'aggiunta di solventi organici al buffer porta ad un decremento nell'EOF
dovuto al decremento del potenziale ζ, che risulta in una più bassa corrente e in un minor calore Joule
nel 1966 Offord propose un'equazione empirica che mette in relazione mobilità (m, in cm^2 V^(-1) s^(-1)) con
carica (Q) e massa (Mr): m=kQMr^(2/3), dove k è una costante. il grafico di m vs Q/Mr^(2/3) darà una linea
retta
mentre l'assorbilmento delle pareti di silice non è solitamente un problema con piccoli peptidi, peptidi più grandi
e proteine possono essere irreversibilmente assorbite sulle pareti dei capillari. questo è uno dei più grossi
problemi riscontrati con la CZE delle proteine. gli sforzi per ridurre l'assorbimento sono stati mirati alla
modifica del doppio strato interfacciale alla parete (potenziale ζ). questo può essere fatto aggiungendo una
piccola quantità (5-10 mM) di ammine cationiche divalenti al buffer. altri modi di modulare la mobilità dei
peptidi consistono nell'aggiungere ioni metallici originati da zinco o sali di rame: essi possono interagire con
certi atomi di N,O o S di proteine e peptidi. questo causa che la mobilità di queste specie diminuisce in relazione
alle specie in cui non sono presenti queste interazioni
sebbene un buffer di bassa forza ionica (I) potrebbe essere valido, dato che permetterebbe gradienti di alta
tensione con bassi effetti Joule, dovuto alla diminuzione della conduttività, molto più bassi valori di I possono
comportare bassa risuluzione e picchi ampi
la quantità totale di sale che può essere tollerata in un campione in CZE, sebbene sia abbastanza limitata
specialmente quando si ricorre all'elettrokinetic sample injection, è spesso richiesta quando il lume dei capillari
è pieno con il liquido polimerico di separazione, dovuto alla loro alta viscosità. aumentando il sale può avere
effetti negativi sull'analita in due modi: abbassando la quantità totale di campione che è inserito nel capillare e
aumentando la forma del picco di distorsione. a causa di ciò, la dissalazione è spesso necessaria, e per i peptidi
può essere tranquillamente ottenuta assorbendoli in "zip tips"
la separazione di proteine, in CZE, è molto più complessa che quella dei peptidi. questi ultimi, essendo piccoli,
sono considerabili meno assorbibili dalle cariche negative della parete di silice. questo perchè quando è il
processo avviene a valori di pH particolarmente acidi, essi acquisiscono cariche positive, mentre le pareti dei
capillari diventano neutrali essendo i silanoli completamente protonati. così ne deriva nessun assorbimento. al
contrario, proteine che contengono una quantità molto maggiore di carica, hanno un rischio di assorbimento alle
pareti molto maggiore, per cui per proteine veramente alcaline l'assorbimento è totale e irreversible così che
l'inserimento nel capillare di suddette proteine non viene mai segnalato al termine della procedura. alcune
proteine possono essere invece assorbite reversibilmente anche se questo processo cromatografico porta come
risultato grandi code dei picchi e perdita di risoluzione
se la miscela di proteine è analizzata a pH particolarmente acidi o alcalinici, non può derivare alcun
assorbimento sulle pareti di silice. nel primo caso perchè le pareti di silice saranno neutrali, nel secondo perchè
sia le pareti che la superficie delle proteine saranno caricate altamente negative così da repellersi a vicenda. in
pratica però queste non sono buone soluzioni, a pH molto acidi le proteine sono denaturate ma sono anche
precipitate fuori dalla soluzione. a pH molto alcalini le proteine possono pure essere denaturate sebbene siano in
una soluzione molto stabile, però la silice si dissolve
per ovviare a questo problema, sono stati proposti una varietà di rivestimenti. tali rivestimenti sono in genere
covalentemente legati con le pareti di silice e consistono in polimeri neutrali a catena lunga. dato che sono
innestati con i silanoli, essi prevengono automaticamente la loro ionizzazione (sebbene non reagiscano per
niente). in più, questi polimeri formano uno strato di picchi nm di lunghezza che penzola dalle pareti. in questo
strato il rivestimento deve per forza essere neutrale. in alcuni casi i rivestimenti sono scelti carichi positivamente
così che a valori di pH moderatamente acidi, sia le pareti che le proteine saranno carichi positivamente e si
respingeranno. in altri casi i rivestimenti possono essere carichi negativamente
altre possibilità, invece che rivestimenti covalenti, possono essere l'uso, nella separazione delle proteine di
zwitterions, come betaina, sarcosina, triglicina. questi composti non contribuiscono alla conducibilità e di
conseguenza possono essere utilizzati ad alte concentrazioni (più di 2M). un altro efficiente additivo è il
propil(trimetil)ammonio solfato (più di 1M), le cui funzionalità dell'ammonio quaternario possono interagire
con i silanoli caricati negativamente
Lo zwitterione o anfoione è una molecola elettricamente neutra nel suo complesso che però presenta sia
cariche positive sia negative localizzate.
altre possibilità, invece che rivestimenti covalenti, possono essere l'uso, nella separazione delle proteine di
polimeri assorbiti che agiscono diminuendo il potenziale ζ delle pareti
un altro potente metodo di separazione delle proteine è l' SDS-PAGE (elettroforesi in gel di poliacrilamide in
presenza di micelle di sodio dodecil solfato), una tecnica molto versatile per una rapida valutazione della
purezza delle proteine e dell'approssimazione di Mr. cmq non è conveniente polimerizzare un vero gel nel lume
di un capillare, visto che spesso il gel si riduce dando origine a bolle d'aria che impedirebbero il passaggio della
corrente. inoltre alcuni materiali possono restare intrappolati nell'interfaccia gel e eluiti in processi futuri. quindi
è molto preferibile riempire il lume capillare con un polimero liquido setacciante al di sopra della soglia di
aggrovigliamento. tale aggrovigliamento, soluzione polimerica viscosa, è altrettanto efficiente nella separazione
proteica del polimero liquido di setacciamento, oggi polimeri trasparenti ai raggi UV sono preferibili
è possibile procedere ad una separazione in CZE di dimensioni pure, così da ottenere una frazione di carica pura
con un IEF.
vantaggi di CZE:
- volumi estremamente piccoli di campione richiesto (5-10nL)
- identificazione on-line (nel capillare)
- l'elettroforesi è eseguita in capillari molto piccoli
- alti voltaggi e alti campi elettrici possono essere applicati lungo il capillare
- alta efficienza e brevi tempi di analisi
- l'elevata resistenza del capillare limita la generazione di corrente e il riscaldamento interno
- l'identificazione è eseguita all'interno del capillare
- necessari solo piccoli volumi di campione
- numerosi metodi per variare la selettività e il campo di applicazione
- opera in ambiente acquoso
principali obiettivi per la preparazione del campione per 2-DE:
- conversione del campione nativo in uno stato fisico-chimico utilizzabile per IEF: il più possibile di proteine
devono essere solubilizzate, disgregate, denaturate e ridotte
- prevenire l'aggregazione delle proteine e la perdita di solubilità durante il focusing isoelettrico
- prevenire la modifica delle proteine post-estrazione, incluse degradazioni enzimatiche o chimiche del
campione proteico
- rimozione delle sostanze interferenti (sali, detergenti ionici, acidi nucleici, lipidi, polisaccaridi)
- produrre proteine di interesse a livelli percepibili, il che potrebbe richiedere la rimozione delle proteine più
abbondanti che interferiscono o delle classi di proteine meno rilevanti
grazie alla grande diversità dei tipi di campioni proteici e delle loro origini, non esiste un metodo universale di
preparazione dei campioni. sfortunatamente, una procedura ottimale deve essere quindi determinata
empiricamente nella maggioranza dei casi il che può essere scoraggiante. cmq, alcune guide generali di
preparazione del campione devono essere tenute presente per evitare errori comuni nel processo di analisi
proteica.
passaggi della preparazione dei campioni:
. solubilizzazione delle proteine
. pulizia del campione
. lisi/rottura della cellula
. frazionamento del campione
rottura della cellula (metodo delicato)
- lisi osmotica: le cellule si gonfiano e esplodono quando sono sospese in una soluzione ipotonica, rilasciando il
loro contenuto cellulare
- lisi per congelamento-sgelamento: le cellule possono essere lise sottoponendole a uno o più cicli di rapido
gelamento con azoto liquido e il conseguente sgelamento
- lisi per detergenti: molti tensioattivi hanno l'abilità di solubilizzare la membrana cellulare delle cellule sospese
in una loro soluzione
- lisi enzimatica: le pareti cellulari possono essere rimosse in soluzioni isoosmotiche da enzimi specifici per il
tipo di cellula
rottura della cellula (metodo drastico)
- sonicazione: una sospensione cellulare, raffreddata in ghiaccio per evitare il riscaldamento, può essere lisa con
brevi scoppi di onde ultrasoniche con forze di taglio
- french pressure cell: le cellule sono lise da forze di taglio costringendo una sospensione cellulare attreverso un
piccolo orifizio ad alta pressione
- frantumazione (grinding): le cellule dei tessuti solidi e dei microorganismi possono essere lise con mortaio e
pestello. di solito il mortaio è riempito con azoto liquido e le cellule o i tessuti sono ridotti a polvere finissima
- omogeneizzazione meccanica: questo approccio è ideale per i tessuti solidi morbidi. strumenti palmari sono
conosciuti col nome di omogeneizzatori di Dounce o di Potter-Elvehjem
- omogeneizzazione con grani di vetro: un vortice di grani di vetro genera un'azione abrasiva e rompe le pareti
cellulari. di solito 1-3g di grani di vetro è aggiunta per ogni grammo di cellule
solubilizzazione proteica:
solubilizzazione, disgregazione, denaturazione e riduzione sono effettuate durante o subito dopo la lisi cellulare
tramite l'utilizzo di agenti caotropici, detergenti, agenti riducenti, buffer e anfoliti trasportatori. i costituenti di
questi buffer devono essere compatibili con IEF, sia elettricamente che chimicamente.
la solubilità proteica teme: i legami a idrogeno, l'idrofobicità, i ponti disolfuro. l'isolubilità proteica porta a
precipitazione quindi a perdita del campione e a precipitazione di artefatti
un classico buffer è il DTT che però può essere sostituito con TBP (tributilfosfina) che ha i vantaggi di non
avere carica, reagire stechiometricamente permettendo una bassa concentrazione di TBP (2nM) e è economico.
gli svantaggi invece sono che è tossico, volatile e puzzolente e in più è labile in acqua
pulizia del campione:
alcune sostanze possono interferire nella preparazione del campione quindi devono essere rimosse. questi sono i
sali, i detergenti ionici (SDS), acidi nucleici, lipidi e polisaccaridi e le soluzioni fenoliche.
i sali aumentano la conduttività, prolungando il tempo richiesto per IEF. a causa dell'elettroendoosmosi (EEO),
risulta una distribuzione irregolare dell'acqua nel gel. si possono rimuovere con: gel filtrazione, TCA/acetone
precipitation, ultrafiltrazione
gli acidi nucleici legano le proteine attraverso interazioni elettrostatiche prevenendo il focusing. possono
ostruire i pori della matrice di acrilamide. si rimuovono con: trattamenti con nucleasi, ultracentrifugazione in
presenza di anfoliti trasportatori
i polisaccaridi possono bloccare i pori della matrice di acrilamide. si rimuovono con la precipitazione TCA
i lipidi legano le proteine tramite interazioni idrofobiche che interessano carica e Mr. i complessi proteina-lipide
sono insolubili in soluzioni acquose. si rimuovono con: presenza di grandi quantità di detergenti nella soluzione
di solubilizzazione. in caso di campioni particolarmente ricchi di lipidi si procede alla delipidazione con solventi
organici.
i tensioattivi ionici formano forti cariche negative complessando le proteine e prevengono il focusing fino a che
SDS non è rimosso. si rimuovono diluendo SDS contenente il campione con alti livelli di detergenti
zwitterionici o non ionici (rapporto 8:1, concentrazione finale di SDS 0.25%)
le soluzioni fenoliche (nelle piante) hanno due effetti: lo stato riducente che lega le proteine con legami a
idrogeno e lo stato ossidativo che porta a legami covalenti. si rimuovono con l'aggiunta di
polivinilpoliporrolidone (PVPP) che intrappola i polifenoli o aggiungendo agenti di riduzione (DTT, ascorbato,
solfiti)
i materiali insolubili ostruiscono i pori del gel peggiorando il focusing. si rimuovono tramite centrifugazione ad
alta velocità
metodo di rimozione di agenti contaminanti tramite precipitazione con protocolli basati su TCA/acetone che è
un metodo molto versatile e aumenta la concentrazione delle proteine ma può portare a perdita di campione
linee guida generali per la preparazione del campione
- tenere la strategia di preparazione il più semplice possibile per evitare la perdita di proteine
- la rottura cellulare dovrebbe essere fatta a basse temperature e idealmente dovrebbe portare direttamente
dentro soluzioni fortemente denaturanti contenenti inibitori di proteasi
- le soluzioni di preparazione del campione dovrebbero essere appena fatte o conservate congelate. dovrebbero
essere usati composti chimici di alta qualità
- campioni che contengono proteine dovrebbero essere conservate in contenitori di ragionevole dimensione a 80° o utilizzati prontamente nel passaggi di IEF. ripetizioni di congelamento e sgelamento dovrebbero essere
evitate
- in presenza di urea, i campioni non devono mai essere scaldati (rischio di carbamilazione)
frazionamento del campione riduce la complessità, aumenta il range di ricerca, incrementa le proteine a bassa
abbondanza
perfino il miglior gel 2D ha un picco di capacità <10000 punti. i punti per gel sono solitamente tra i 500 e i 2000
in base alla dimensione del gel, alla sensitività della colorazione e al range di pI. il caricamento del campione
limita il conteggio degli spot per proteine con bassa abbondanza.
si può ridurre la complessità di un campione tramite la separazione in frazioni in base a: locazione cellulare,
solubilità/idrofobicità, caratteristiche di affinità, massa molecolare, carica/pI
le diverse tecniche di frazionamento utilizzate nell'analisi proteomica sono: centrifugazione, reagenti chimici,
cromatografia (IEX, affinità...), elettroforesi (punto isoelettrico, massa molecolare...)
soluzione con reagenti chimici: è basata sulla solubiltà delle proteine in un range di temperature, buffer e
soluzioni detergenti
soluzione con cromatografia: basata su assorbimenti differenti della fase stazionaria, le proteine sono separate in
base a carica, dimensione, affinità. gli svantaggi sono che i sali devono essere rimossi successivamente
soluzione con elettroforesi: separazione in campi elettrici basata sul punto isoelettrico o sul rapporto
carica/massa
PrepCell: i campioni sono separati sul gel. le molecole sono: poste sul fondo del gel, fermate con
membrane di dialisi, spazzate dentro e fuori con un buffer di eluizione, raccolte come frazioni.
soluzione di frazionamento con pI: aumenta la visibilità delle proteine a bassa abbondanza: aumenta il
caricamento delle proteine, accoppiato con micro range IPG, accoppiato con SDS-PAGE, aumenta la
risoluzione, il range dinamico di investigazione. particolarmente utile con proteine ad alto peso molecolare,
proteine idrofobiche o di membrana, proteine ad alto pI
preparazione di campione per analisi a valle
1. pulizia delle frazioni con precipitazione di TCA/acetone . risolubilizzazione proteica di un buffer compatibile
a valle
2. cromatografia a interazione idrofilica/SPE
. separazione in ordine inverso rispetto al classico RPC:
-eluizione da altamente organici a poco organici
-eluizione in ordine di polarità aumentata
. aspetti pratici "eluizione compatibile:
- 2D sample buffer
- SDS-PAGE sample buffer
- HPLC loading buffer
fallire il raggiungimento di un'alchilazione completata precedentemente alla prima dimensione può portare a un
gran numero di spot spuri nella mappa 2D finale
composizione classica del mezzo di solubilizzazione
50 mM Tris
7M UREA
2M THIOUREA
2% detergenti
3mM TBP o 50 mM DTT
10-100 mM agenti alchilanti (alchilazione precedente alla prima dimensione)
CONCLUSIONI
. per evitare che IAA (iodoacetamide) sia ripulito dalla thiurea, tali agenti di alchilazione devono essere aggiunti
o come solidi o come soluzioni concentrate in acqua
. sotto le stesse condizioni sperimentali e tempi estesi (24h) l'acrilamide è essenzialmente inattivo con thiurea, il
che lo rende più adatto all'alchilazione
. eseguendo riduzione/alchilazione prima alla prima dimensione sembra di ridurre alcuni artefatti
- si riducono le macchie spurie nella mappa 2D finale
- si riduce la formazione di macroaggregati (particolarmente in campioni complessi) che tendono a
ostacolare il transfer delle proteine da strisce IPG a lastre di SDS-gel
abbiamo visto che:
- 70% delle reazioni di alchilazione hanno bisogno di 5min di incubazione
- è impossibile comandare la reazione al 100%
- quando si alchila durante la notte, occorrono reazioni spurie (soprattutto di ƹ-NH3 di Lys)
- la thiurea è un efficace ripulitore di iodoacetamide (IAA)
- non c'è molta differenza nel potere di alchilazione tra IAA e acrilamide
elettricità è essenziale ma la preparazione del campione è fondamentale
carbamilazione:
- preparazione/conservazione del campione devono essere corrette (o <24h o < 80°C)
- il campo elettrico è protettivo
- non viene registrata carbamilazione durante IEC/MCE
alchilazione:
- il campo elettrico può essere distruttivo
- spinge l'alchilazione non cisteinica
- E' ESSENZIALE SMORZARE L'ECCESSO DI AGENTI DI ALCHILAZIONE
β-eliminazione:
- il campo elettrico può essere distruttivo
- eliminate le cisteine non alchilate - distruzione delle proteine
- l'alchilazione con l'acrilamide porta protezione
PRIMA PARTE: metodi più applicabili ai gel 2D
SECONDA PARTE: metodi particolarmente adatti agli approcci cromatografici multidimensionali e/o tecniche
ibride
parte prima:
1) analisi differenziale di gel macchiati con software dedicati (es. PDQuest)
PRO: metodo robusto, ben testato; software costantemente raffinato fin dagli anni '80; il più popolare nell'analisi
di mappe 2D
CONTRO: tempistica lunga; intensa lavorazione; grande quantità di campione richiesto
2) DIGE: elettroforesi in-gel differenziale (un singolo gel, 2-3 differenti fluorofori)
PRO: analisi differenziale eseguita su un singolo gel
CONTRO: costosi agenti chimici; costosi hardware e software; derivazione della Lys altamente critica
3) CLASSIFICAZIONE differenziale con d0/d3 acrilamide su residui di Cys
- AGENTI ALCALIZZANTI ISOTOPICALMENTE MARCATI
PRO: facile derivazione di Cys; acrilamide facimente disponibile e economica
CONTRO: reazione fortemente quantitativa; classificazione limitata ai residui di Cys; ca 10% della popolazione
proteica è invisibile
4) DIGE con etichettatura sui residui di Cys
PRO: più alta sensibilità che con etichettatura basata su Lys; analisi differenziale performata su un singolo gel
CONTRO: classificazione limitata ai residui di Cys; ca 10% della popolazione proteica è invisibile; spostamento
degli spot a più alti livelli di Mr; costosi hardware, software e agenti chimici
parte seconda:
ICAT - isotope coded affinity tags
PRO: cattura di affinità riduce drasticamente la complessità del peptide
CONTRO: reazione altamente quantitativa (peggio che quella con acrilamide); classificazione limitata ai residui
di Cys; ca 10% della popolazione proteica è invisibile; reagenti estremamente costosi; problemi addizionali se
utilizzata nelle mappe 2D
se un campione viene prefrazionato, nella mappa 2D si vede il 30% di proteine in più
ROTOFOR e apparato FFE (octopus) lavorano entrambi in fase libera
separazione off-gel con multi-cup devices composto da pozzetti: quando viene acceso il C.E. (campo elettrico),
il liquido dei pozzetti si carica e le proteine migrano nel gel fino al loro punto isoelettrico e poi salgono nel
cilindro soprastante
perchè ci interessano le proteine di membrana e le proteine a bassa abbondanza?
ragioni biologiche: sono recettori, sono fattori di trascrizione, etc etc
ragioni tecniche: per provare che può essere fatto, per difendere gli innocenti e gli inermi
analisi proteomica 2D o no?
Gygi: impossibile trovare le proteine a bassa abbondanza, la mappatura 2D non è adatta agli studi di proteomica
Yates: si trovano proteine a bassa abbondanza, proteine di membrana, proteine con pI estremi
il codon bias come misura di abbondanza proteinca
- quando esistono codoni multipli per lo stesso amminoacido, il codon bias è la probabilità che solo un codone
sarà utilizzato per il dato amminoacido
- CBI codon bias index
- CAI codon adaptation
- le proteine a bassa abbondanza hanno CAI o CBI minore di 0.2
più dell'80% degli ORFs (open reading frame) dei lieviti codificano proteine a bassa abbondanza
il 30% degli ORFs codifica proteine di membrana
più dell'82% degli ORFs di transmembrana codificano proteine a bassa abbondanza
in teoria in una mappa 2D si notano 2/3 di proteine acide e 1/3 di proteine basiche
non si riescono a vedere più proteine sui gel per due motivi:
- i problemi del range dinamico: proteine abbondanti, sensività al colore, capacità di carico del gel, le proteine a
bassa abbondanza sono almeno espresse?
- la risoluzione: proteine co-migranti, proteine abbondanti che oscurano quelle meno abbondanti, selezione del
gradiente di pH
come si può aumentare la risoluzione?
limitati gradienti di range di pH aumentano la risoluzione: con tecnologia IPG (immobilised pH gradient), con
gradienti con ampiezza delle unità di pH minori di 0.1, con più alta capacità di carico su range di pH stretti
perchè non è stato fatto?
perchè solo recentemente è stato reso disponibile commercialmente un gradiente di pH di 1, perchè la maggior
parte delle persone utilizza l'approccio " 1 estrazione - 1 gel", perchè la maggior parte dei gel con range ridotti e
alti carichi falliscono
la chiave è il frazionamento
il frazionamento isoelettrico permette:
- frazionamento in poco sale -> soluzione compatibile con IPG
- alti carichi delle proteine corrette in ristretti IPG
- rimozione delle proteine abbondanti
- aumento della risoluzione
l'elettrolizzatore multicompartimento provvede:
- tecnologia a gradiente di pH immobilizzato
- frazionamento riproducibile
- frazioni molti piccole
- alto carico di campione
identificazione proteica variante splice
. la proteina è spliced (viene tagliato via un frammento interno e le due estensioni sono ricongiunte ABC->AC)
per produrre due proteine mature
. AC (forma rilegata) è un H^(+) - ATPase che è attaccato ad un complesso integrale di membrana porosa
. B è un sito specifico solubile endonucleasi
. la copertura peptidica include il sito di splice