Instabilità meiotica e mitotica

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Coppola Eva, Sannino Maria, Tonziello Gilda, Vitiello Carmen, Vitiello
Laura.
Atassia di Friedreich
o Introduzione
o Il gene FRDA
o Espansione delle triplette GAA e mutazioni puntiformi
o Instabilità meiotica e mitotica
o Correlazione genotipo-fenotipo
o La frataxina
o Considerazioni epidemiologiche
o Considerazioni bioetiche
Introduzione
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.
Le patologie denominate “disordini da tripletta” possono essere suddivise in due ampi gruppi:

Tipo I, caratterizzate da una progressiva degenerazione neuronale. Di questo gruppo
fanno parte il Morbo di Huntington, l’atrofia muscolare spinale e bulbare, il morbo di
Machado-Joseph, l’atrofia spino-cerebellare, ecc. In genere le espansioni alleliche sono
minori che nelle malattie di tipo II. In quasi tutti i disordini di tipo I, comunque, le triplette
ripetute codificano per una sequenza di poliglutammine all’interno di una regione
codificante. Ciò altera l’espressione e la funzione della proteina stessa, con l’acquisto di
nuove caratteristiche.

Tipo II, caratterizzate da una molteplicità di sintomi, che comprendono debolezza, difetti
nella conduttanza a livello cardiaco, miotonia dei muscoli periferici, ritardo mentale.
Queste patologie comprendono l’atassia di Friedreich, la distrofia miotonica, la sindrome
della X fragile.
L’atassia di Friedreich (FRDA) è l’atassia ereditaria più comune. La sua prevalenza è circa
2x10-5 nelle popolazioni studiate, con una maggiore incidenza in alcune regioni, come il
Quèbec , Cipro ecc. L’incidenza nei bambini neonati nel sud Italia è state stimata intorno ai
4.9x10-5.
Diversamente dalle malattie da tripletta di tipo I (dominanti) e dalle altre patologie di tipo II in
cui, a causa delle modalità di trasmissione anche negli eterozigoti si ha generalmente uno
svantaggio riproduttivo, nell’atassia di Friedreich gli alleli espansi sono trasmessi da portatori
asintomatici, la cui fitness riproduttiva è nella norma. L’assenza di una selezione contro gli
eterozigoti gioca un ruolo importante nel mantenere la frequenza degli alleli espansi di 1/250
cromosomi, ovvero di almeno un ordine di grandezza superiore a quelle delle altre malattie da
tripletta.
L’atassia di Friedreich è una malattia autosomica recessiva, causata da un’espansione della
sequenza GAA ripetuta nel primo introne del gene X25, che mappa sul cromosoma 9q13 e
che codifica per la frataxina, la cui funzione è tuttora sconosciuta.
Le principali caratteristiche cliniche sono: insorgenza prima dei 25 anni, progressiva atassia
degli arti, riflessi tendinei assenti negli arti inferiori, segno di Babinski, neuropatia degli assoni
sensitivi, seguita, nell’arco di 5 anni, da disartria, riflessi assenti in tutti e 4 gli arti, e così via.
Anche se i suddetti criteri diagnostici permettono di identificare con sicurezza i casi tipici di
FRDA, questo disturbo è soggetto ad una enorme variabilità clinica, che si riflette soprattutto
sull’età dell’insorgenza, la progressione dei sintomi, e la severità degli stessi. Nei casi più
gravi si osservano anche cardiomiopatia, cifoscoliosi, piede cavo, atrofia ottica, perdita
dell’udito, diabete mellito.
Alcuni studi hanno dimostrato che l’età di insorgenza, la velocità della progressione dei
sintomi, nonché la loro gravità, sono strettamente correlate con il numero di triplette GAA
ripetute. La spiegazione più verosimile di questo fenomeno è che piccole espansioni
consentirebbero un’espressione residua della frataxina, al contrario delle grandi espansioni.
Nella atassia di Friedreich non si osserva il fenomeno dell’anticipazione (ovvero la precocità
dell’insorgenza dei sintomi nei figli rispetto ai genitori), per due motivi:
1) La malattia è autosomica recessiva (quindi i genitori sono generalmente portatori sani).
2) La fitness riproduttiva degli individui affetti è bassa.
Alcune varianti fenotipiche della FRDA sono:
-FRDA Acadiana, una forma clinica che presenta un ritardo nell’età di insorgenza e nella
progressione dei sintomi, nonché una più bassa frequenza di soggetti con cardiomiopatia.
2
..
.
-LOFA (Late Onset.. Friedreich Ataxia), con un’insorgenza dopo i 25 anni.
-FARR (Friedreich..Ataxia with Retained Reflexes), nella quale i riflessi degli arti inferiori sono
..
conservati.
Il gene FRDA
Il gene responsabile dell' atassia di Friedreich, FRDA, noto anche come X25, è composto da
sette esoni (da 1,2,3,4,5a,5b e 6), e copre una regione di circa 95 kb. La trascrizione procede
in direzione centromero-telomero. Il locus che lo contiene presenta diverse Cpg island, e
alcuni siti di restrizione rari. Il sito d'inizio della trascrizione è preceduto da diversi codoni di
stop. Il trascritto è di circa 1.3kb, e comprende gli esoni da 1 a 5: gli esoni 5a e 5b sono
presenti alternativamente; l'esone 6 invece non è codificante.
Il gene è espresso nei tessuti ad alto consumo di energia, come il cuore, il fegato, il muscolo
scheletrico, il pancreas, il timo e il grasso bruno. Nel S.N.C. è espresso principalmente nella
spina dorsale ( a livello toraco-lombare ), mentre è espresso a livelli minori nel cervelletto e
nella corteccia cerebrale. È interessante notare che alcuni tessuti che esprimono il gene ad
alti livelli non sono in effetti colpiti nella FRDA, mentre altre popolazioni cellulari, come i
neuroni corticospinali e quelli spinocerebellari, che lo esprimono a livelli minori, sono coinvolti
nella malattia.
Il gene è espresso anche nell' embrione, a livelli superiori rispetto all' adulto (esperimenti in
topo).
Espansione delle triplette GAA e mutazioni puntiformi
L'espansione della tripletta GAA, responsabile della perdita di funzione del gene , è
localizzata nel primo introne, fiancheggiata da due sequenze Alu, 1.4 kb a valle del primo
esone. In base al numero di ripetizioni, gli alleli si possono classificare in piccoli normali (fino
a 10 ripetizioni), grandi normali (da 13 a 40), e patologici ( da 100 a più di 1700 ripetizioni).La
ripetizione è preceduta da una sequenza A 6TACAA16, che è una variante della sequenza che
generalmente lega le due metà di una sequenza Alu. Questa sequenza è polimorfica: la
variante VpA ha una delezione di 6 bp, e mostra un linkage con gli alleli normali: infatti è otto
volte più frequente nei normali rispetto agli espansi.
Sono stati ritrovati degli alleli normali e stabili con più di 34 ripetizioni: questi contengono la
sequenza GAGGAA che spezza la continuità della ripetizione e stabilizza l'allele.
La gravità della malattia correla con la grandezza dell'espansione, che sembra avere effetti di
inibizione della trascrizione. L'inibizione è dipendente dalla lunghezza e dalla direzione della
trascrizione. Il blocco nella trascrizione è probabilmente determinato dalla formazione di una
struttura del DNA non-B, stabilizzata a pH fisiologico da legami di Hoogsteen. La struttura è
una tripla elica. In seguito all'introduzione di superavvolgimenti negativi a monte della
polimerasi, il filamento ricco in purine si dissocia dal suo complementare e va a legarsi nel
solco maggiore di un tratto purpyr più a monte, formando un triplex. Il tratto ricco in
pirimidine, a singolo filamento, rimasto libero viene stabilizzato dall' RNA trascritto prima dellla
formazione della tripla elica (Fig.1). È stato inoltre proposto che l'inibizione potrebbe essere
dovuta anche alla distruzione della sequenza Alu, che potrebbe funzionare come enhancer.
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Fig.1: Possibili strutture del DNA di tipo non-B che una
sequenza ripetuta GAA potrebbe assumere.
Il 93% dei pazienti FRDA è omozigote per espansioni nel gene FRDA. Nel rimanente 7%, i
pazienti sono eterozigoti per l'espansione. Sono state descritte diverse mutazioni nell' allele
normale presente: mutazioni missense (G130V, M1I e I154F, la più frequente nel Sud Italia),
mutazioni nonsense (Leu106Stop), mutazioni nei siti di splicing (IVS3, A-G, -2), inserzioni e
delezioni. Non sono mai stati ritrovati omozigoti per queste mutazioni, probabilmente perché
sono incompatibili con la vita. Mutazioni localizzate nell'estremità N-terminale danno fenotipi
meno gravi rispetto a mutazioni che interessano la parte C-terminale.
Instabilità meiotica e mitotica
È stato dimostrato che, dal 70 al 100% dei casi studiati, le triplette iperespanse GAA sono
altamente instabili durante la meiosi, ovvero durante la trasmissione intergenerazionale.
Questa variabilità nel numero di triplette ripetute non sembra dipendere da sequenze
fiancheggianti le espansioni. Infatti non è stata osservata nessuna correlazione fra specifici
aplotipi e tendenza a espansioni o contrazioni. È stata sottolineata una generale alta
frequenza di contrazioni del numero di triplette fra genitore e figlio, con eventi comunque
osservati ma meno frequenti di espansioni. Nessuna reversione ad alleli di dimensioni normali
è comunque mai stata studiata. È ben documentata inoltre una correlazione fra instabilità
meiotica e sesso del genitore che trasmette l’allele iperespanso. Infatti, la trasmissione
materna sembra avvenire in maniera casuale: esiste una uguale probabilità che si verifichino
contrazioni o espansioni, e ciò è indipendente dal numero di triplette GAA ripetute, presenti
nell’allele materno. Nella trasmissione paterna c’è un’elevata tendenza alla contrazione, e
incrementi nel numero di GAA sono stati osservati molto raramente e per un numero di
ripetizioni appartenenti ad un range basso (<800 GAA). Questo può significare che, durante
la spermatogenesi, potrebbe esserci uno specifico processo di selezione negativa contro alleli
iperespansi o un particolare meccanismo di riparo che porta alla loro compressione. Per
ripetizioni di 5-20 GAA la trasmissione è accurata e variazioni in lunghezza non sono mai
state riportate.
Con l’analisi del DNA estratto dallo sperma è stato possibile evidenziare il fenomeno della
instabilità meiotica anche in assenza di dati sulla progenie: è stata osservata la presenza di
alleli con un numero di ripetizioni GAA nel DNA di origine spermatica variabile e inferiore
rispetto a quello riscontrabile nel DNA leucocitario in uno stesso individuo (Fig.2). Questa
metodica ha concesso di evidenziare anche il processo dell’instabilità mitotica: infatti in alcuni
casi studiati, il numero delle triplette iperespanse è stato dimostrato differente fra alleli
4
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presenti nel DNA.. leucocitario, nel DNA spermatico e in figli affetti, per i quali era stata
.. la derivazione paterna dell’allele espanso.
univocamente stabilita
Inoltre, autopsie o.. biopsie in individui con FRDA hanno consentito di rilevare un numero
diverso di espansioni di triplette GAA nell’introne 1 del gene X25 in tessuti diversi,
determinando un mosaicismo somatico per questo carattere. L’instabilità mitotica non è
frequentemente osservata quando le ripetizioni sono inferiori alle 100 GAA. Tutto ciò
permette di ipotizzare che il processo di instabilità si verifica in due fasi: una prima prezigotica, durante la produzione dei gameti, e una seconda post-zigotica. Non sono comunque
emersi finora dati delucidanti sulla relazione fra mosaicismo somatico e manifestazioni
cliniche della FRDA.
Fig.2: Amplificazione per PCR di DNA spermatico e leucocitario
da tre carriers per il gene FRDA espanso.
Correlazione genotipo-fenotipo
È stata dimostrata l’esistenza di una relazione inversa fra numero di triplette iperespanse ed
età di esordio della FRDA, diretta fra numero di triplette iperespanse e incidenza di diabete
mellito e cardiomiopatie: maggiore è il numero di ripetizioni nell’allele meno espanso presente
in uno stesso paziente, inferiore presumibilmente sarà l’età di esordio della patologia e
maggiore sarà l’incidenza di diabete mellito e cardiomiopatie. Questo può essere spiegato
considerando che l’allele meno espanso potrebbe rappresentare l’attività residua del gene.
Queste correlazioni sono statisticamente più significative per numeri di ripetizioni patologiche
comprese in un range basso.
Inoltre, è stata evidenziata un’associazione fra il numero di ripetizioni GAA e le varianti
cliniche di FRDA finora descritte. Un numero di triplette inferiore a 500-800 nell’allele meno
espanso è stato dimostrato associato alla variante clinica LOFA, mentre i pazienti con FARR
non evidenziano nessuna peculiarità genetica (Fig.3): è stato osservato che spesso il numero
di ripetizioni è inferiore rispetto a pazienti con classica FRDA, ma è maggiore rispetto a
individui affetti da LOFA. Il differente fenotipo fra classica FRDA, LOFA e FARR può essere
quindi solo parzialmente spiegato su basi esclusivamente genetiche.
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Fig.3: Distribuzione delle dimensioni degli alleli
espansi in un gruppo di pazienti affetti da FA classica, LOFA o FARR.
La frataxina
La frataxina è una proteina di 210 aminoacidi, codificata dal trascritto più abbondante del
gene X25, che va dall’esone 1 all’esone 5a. Una seconda proteina di 171 aminoacidi è
codificata dal trascritto generato per splicing alternativo, contenente l’esone 5b in sostituzione
al 5a. Questa proteina presenta una forte omologia con proteine presenti nel topo, in
C.elegans e in S.cerevisiae (con identità di sequenza del 73%, 49% e 31%, rispettivamente)
e nei batteri Gram negativi.
YFH1 (yeast frataxin homologue) presenta all’estremità N-terminale una sequenza di
localizzazione mitocondriale. Ciò ha fatto pensare ad una simile localizzazione per la
frataxina umana: studi di doppia immunofluorescenza condotti con anticorpi anti-frataxina e
anticorpi specifici per proteine mitocondriali, hanno dimostrato che la frataxina si trova sulla
membrana mitocondriale interna.
Studi condotti in cellule di lievito wild type hanno mostrato che YFH1 è soggetta ad un
processo di maturazione che si esplica in 2 fasi e coinvolge l’estremità N-terminale:
 il primo taglio rimuove 2 kD
 il secondo taglio rimuove altri 4kD.
Una proteina appartenente alla famiglia delle heat-shock proteins 70, chiamata ssq1p sembra
essere coinvolta nel processamento di YFH1 nei mitocondri, infatti in mutanti di ssq1p il
secondo taglio è cineticamente rallentato e mostrano un fenotipo simile ai lieviti K.O. per
YFH1.
La distruzione di YFH1 nel lievito comporta la formazione di cloni che non riescono a crescere
in mezzi contenenti fonti di carbonio non fermentabili come il glicerolo e l’etanolo. Ciò è indice
di un deficit nella catena respiratoria. Inoltre, i lieviti K.O. per YFH1 mostrano una totale
assenza del DNA mitocondriale, suggerendo l’importanza di YFH1 nel mantenimento della
integrità di quest’ultimo. Per questa funzione risulta importante la parte C-terminale della
proteina, che è molto conservata. Ciò può spiegare la gravità della patologia clinica associata
a mutazioni missenso che coinvolgono questa regione (cambio di isoleucina in fenilalanina in
posizione 154). Non sono mai stati riportati pazienti omozigoti per mutazioni puntiformi che
aboliscono la produzione della proteina: la totale assenza di frataxina, che nel lievito causa
deplezione del DNA mitocondriale, nell’uomo potrebbe essere incompatibile con la vita. In
aggiunta, i lieviti K.O. per YFH1 mostrano un aumento nel contenuto di ferro, soprattutto a
livello mitocondriale che, reagendo con l’ossigeno, causa un aumento dei radicali liberi
dell’ossigeno (ROS) con ossidazione dei componenti cellulari e conseguente danno cellulare
irreversibile.
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Nelle cellule dei pazienti
affetti da FRDA non si osserva l’assenza del DNA mitocondriale,
.. deficit
poiché c’è un parziale
della frataxina, non una completa assenza come nel modello del
.
.
lievito. Il principale
. meccanismo di danno cellulare sembra essere lo stress ossidativo,
associato ad un aumento del contenuto di ferro a livello mitocondriale. E’ stato, inoltre,
dimostrato un deficit nella catena respiratoria, soprattutto nelle proteine contenenti centri
ferro-zolfo (complessi I, II, III, aconitasi mitocondriali e citosoliche) che sono molto sensibili ai
radicali liberi: la loro inattivazione suggerisce un aumento dello stress ossidativo nei tessuti
affetti. La produzione di ROS nei mitocondri avviene soprattutto a livello del complesso III,
dove l’ubichinone ridotto può ridurre direttamente l’ossigeno molecolare a ione radicale
superossido. Generalmente la SOD2 (superossido dismutasi 2) converte lo ione radicale
superossido (O2¯) in perossido di idrogeno (H2O2) che, a sua volta, in una reazione
catalizzata dalla glutatione perossidasi, reagisce con il glutatione, generando glutatione
ossidato e acqua (H2O). L’eccesso di ferro, osservato nelle cellule FRDA, può intervenire in
questo processo, poiché è un importante cofattore nella reazione di Fenton:
Fe(III)+O2¯+2H+ Fe(II)+ H2O2
Fe(II)+ H2O2Fe(III)+°OH+OHMediante questa reazione si forma il radicale idrossilico (°OH), a breve emivita a causa della
sua alta reattività, che porta alla perossidazione lipidica e al danno ossidativo del DNA e
proteine (Fig.4).
Un’ulteriore conferma del ruolo del danno ossidativo nella patogenesi di FRDA è data
dall’osservazione che l’assenza della -tocopherol transfer protein, necessaria per il
metabolismo della vitamina E, un importante agente anti-ossidante, provoca una patologia
con manifestazione clinica simile a FRDA.
Sebbene esista una parziale correlazione tra la normale distribuzione dell’espressione della
frataxina ed i siti più colpiti dalla malattia, sono state notate alcune discrepanze:
 diversi tessuti non colpiti da FRDA, come fegato, muscolo, timo, tessuto adiposo bruno
esprimono normalmente alti livelli frataxina;
 al contrario, neuroni colpiti dalla malattia (fasci corticospinali e spino-cerebellari)
esprimono normalmente bassi livelli di frataxina.
Questa discrepanza può essere in parte spiegata con la diversa sensibilità dei tessuti al
deficit di frataxina che potrebbe essere legata o al tipo di metabolismo tissutale (glicolitico o
aerobio) oppure ai diversi meccanismi con cui il ferro è esportato dai mitocondri. Infatti la
frataxina potrebbe essere meno importante per le cellule (ad es. gli epatociti) che esportano il
ferro dai mitocondri soprattutto come ferro incorporato nel gruppo eme. Attualmente non
esiste alcuna terapia per l’atassia di Friedreich, anche se studi condotti in vitro su fibroblasti di
pazienti affetti da FRDA hanno dimostrato un ruolo protettivo, nei confronti dello stress
ossidativo, dei chelanti del calcio e del ferro e di inibitori dell’apoptosi, processo che in queste
cellule risulta aumentato.
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..
..
.
Fig.4: Schema delle modificazioni nel
metabolismo del ferro e della produzione di radicali liberi
che potrebbero essere causate da deficit di frataxina.
Considerazioni epidemiologiche
L’atassia di Friedreich, pur essendo la più comune fra le atassie ereditarie, rimane una
patologia genetica rara. In tabella 1 sono mostrati dati derivanti da studi di prevalenza di
atassia di Friedreich su 100.000 abitanti in differenti aree europee, effettuati agli inizi del
1989.
Area in studio
Svezia
Ovest Norvegia
Benghazi (Libia)
Zealand (Danimarca)
Cantabria (Spagna)
Torino (Italia)
Molise (Italia)
Prevalenza
1.2
1.0
0.4
0.8
4.7
1.0
2.1
TAB.1: Prevalenze di atassia di Friedreich in diverse aree
europee.
Tenuto conto della piuttosto recente scoperta di numerose varianti fenotipiche di FA, è stato
stimato che esiste una probabilità del 40% che negli studi epidemiologici riassunti in tabella 1
sia stata mancata la diagnosi (ovvero, 40 pazienti su 100 potrebbero essere stati considerati
non affetti da FA quando invece lo erano). Questo suggerisce che i dati riportati in tabella 1
sottostimano significativamente le prevalenze, pur rimanendo comunque importanti punti di
riferimento nella comprensione delle dimensioni del problema.
In media, la prevalenza di atassia di Friedreich nei Caucasici viene considerata attualmente
dalla comunità scientifica pari a 2 su 100.000 abitanti. La frequenza dei carriers nella
popolazione è stimata essere 1 su 110 individui. Di questi, il 3% possiede un allele normale
con un numero di triplette compreso fra 34 e 36 e può generare prole con alleli espansi (caso
di premutazione se l’allele non è interrotto dall’esanucleotide GAGGAA). Negli Asiatici e negli
Africani la FA è praticamente assente. Considerando che la durata della malattia è di circa 30
8
..
.. aspettativa di vita è di circa 70 anni, è possibile calcolare l’incidenza
anni e che una normale
.. che è pari a 4.9 ogni 100.000 nati fra i Caucasici (2x10-5 x 70/30).
alla nascita di FRDA,
..
Condizioni che potrebbero
modificare le frequenze della patologia in specifiche aree sono:
.
Effetto fondatore: in aree particolarmente isolate. Solo in pochissimi casi è stato possibile
associare l’aumento di frequenza di FRDA a tale fenomeno e, comunque, i dati rimangono
controversi.

Consanguineità: essendo la FRDA una malattia a ereditarietà recessiva, aree in cui sono
favoriti i matrimoni fra consanguinei presenterebbero una frequenza maggiore della
patologia. Ciò può spiegare le differenze di prevalenza fra il nord e il sud Italia (nel sud
Italia si verificano matrimoni fra consanguinei con una frequenza maggiore del 10%
rispetto al nord Italia). È da ricordare che nei paesi musulmani il 40% dei matrimoni si
effettuano fra consanguinei: non sono però disponibili dati di prevalenze attendibili in
questi paesi.
Alla luce di quanto detto, è possibile effettuare considerazioni epidemiologiche piuttosto
dettagliate:


Situazione nei paesi Americani ed Europei
Abitanti considerati = 2 x 109.
Malati FRDA stimati sulla base della prevalenza media = 4 x 104.
Carriers stimati = 1.8 x 106.
Carriers stimati con N° repeats fra 34 e 36= 5 x 105.
Nati ogni anno (stima) = 1 x 108.
Neonati malati FRDA ogni anno = 5 x 103.

Situazione in Campania e Molise
Abitanti considerati = 7 x 106.
Malati FRDA stimati sulla base della prevalenza media = 140.
Carriers stimati = 6.3 x 104.
Nati ogni anno (stima) = 4 x 104.
Neonati malati FRDA ogni anno = 2.
Epidemiologia delle mutazioni puntiformi
In studi svolti prevalentemente in Italia è stato stimato che circa il 7% dei pazienti affetti da
FRDA è un eterozigote composto, ovvero presenta un allele FRDA espanso patologicamente
su un cromosoma e un allele di dimensioni normali, ma contenente una mutazione puntiforme
sul restante cromosoma (3% dei cromosomi FRDA presenta una mutazione puntiforme). È
stato calcolato che, nella popolazione americana ed europea, il 24% degli eterozigoti
composti presenta la mutazione G130V, mentre il 20% presenta I154F. Le altre mutazioni
puntiformi identificate sono state descritte in singoli e isolati casi. In Italia meridionale è
interessante notare che il 50% degli eterozigoti composti presenta la mutazione I154F.
Tenendo presenti questi dati si possono effettuare le seguenti considerazioni:

Epidemiologia delle mutazioni puntiformi nei paesi Americani ed Europei
Numero di eterozigoti composti = 3200.
FRDA presentanti la mutazione G130V = 760.
Incidenza alla nascita di eterozigoti composti presentanti la mutazione G130V = 84 nuovi casi
ogni anno.
Carriers di mutazioni puntiformi stimati = 1125, ovvero lo 0.06% dei carriers totali. Di questi,
l’1.5% presenta la sostituzione G130V.
9
..
. delle mutazioni puntiformi in Campania e Molise
 Epidemiologia.
.. composti = 11.
Numero di eterozigoti
.
FRDA presentanti ..la mutazione I154F = 5.
Considerazioni finali
Abbiamo cercato di individuare regioni o stati possibilmente interessati all’acquisto di test di
diagnosi molecolare di atassia di Friedreich. Abbiamo così considerato tra i futuri acquirenti
Canada, USA, Centro/Sud America, Spagna, Francia, Italia, Regno Unito, Scandinavia,
Europa dell’Est, Medio Oriente. Sapendo che le frequenze di FA nei suddetti paesi sono
diverse e che tali paesi differiscono per dimensioni, condizioni socio-economiche, sanitarie,
ecc. abbiamo tentato di calcolare in maniera approssimata quanti centri specializzati in
diagnosi di FA possono o potranno in futuro esistere. Il numero a cui siamo giunte è circa 30
centri diversamente distribuiti nelle aree sopra elencate.
Dato per vero questo dato, e considerata omogenea la distribuzione dei pazienti nelle aree
suddette, abbiamo effettuato le seguenti osservazioni:
Numero pazienti FRDA afferenti ad ogni centro = 1334.
Numero dei nuovi nati affetti da FA afferenti ad ogni centro = 134 ogni anno.
Numero carriers afferenti ad ogni centro = 6 x 105.
Numero eterozigoti composti presentanti la mutazione G130V afferenti ad
ogni centro = 26.
Numero carriers di mutazioni puntiformi afferenti ad ogni centro = 37.
Dai dati riportati è possibile comprendere il motivo per cui abbiamo deciso di non inserire nel
kit diagnostico per FRDA una metodica di ricerca di mutazioni puntiformi, essendo esse
estremamente rare.
Considerazioni bioetiche
Negli ultimi anni, l’avanzare delle conoscenze e lo sviluppo di nuove tecnologie atte allo
studio di malattie ereditarie hanno consentito l’ideazione di numerosi test genetici basati su
metodiche di biologia molecolare. Questi possono essere usati su pazienti sintomatici per
confermare una diagnosi clinica (test diagnostico), o su pazienti asintomatici per predire
l’insorgenza di una patologia ad esordio tardivo (test predittivo su individui in età infantile o
neonatale, test prenatale su feti), per accertare lo stato di carrier asintomatico (test di carrier)
e così via. Generalmente, l’utilizzo di test diagnostici è stato accettato con poche diffidenze, in
quanto non può che apportare benefici per il paziente e la sua famiglia sia da un punto di
vista clinico (possibilità di una corretta diagnosi, eventuale inizio di una terapia, ecc.) che
psicosociale. L’impiego di test genetici su individui asintomatici, invece, ha portato alla nascita
di numerosi problemi etici e legali, che possono sintetizzarsi in un’unica domanda: informare
un individuo sulla sua condizione di carrier o prossimo ammalato promuove sempre il suo
futuro benessere o può avere anche implicazioni negative?
Finora, non è stata approvata nessuna normativa che regolamenti l’uso di test genetici su
individui asintomatici, ma solo linee-guida sono state tracciate da specifiche commissioni
bioetiche sia negli USA che in Europa.

Linee-guida negli USA
Negli USA sono stati fissati dei criteri fondamentali, da considerare nel decidere di effettuare
un test genetico su un individuo asintomatico:
10


..
..
Stabilire i potenziali
rischi e benefici: un test genetico va effettuato avendo come unico
.. benessere
scopo il futuro
dell’individuo. I possibili benefici devono comprendere sia
.
.
l’ambito clinico
. (eventualità di terapia, prevenzione, sorveglianza, definizione di
prognosi, ecc.) che psicosociale (riduzione dell’ansia da incertezza, impatto sulla
considerazione di sé e sulle relazioni familiari e sociali, sulla pianificazione della vita
futura, del comportamento riproduttivo, ecc.). Il bilancio fra rischi e benefici deve essere
chiaramente a favore dei benefici per consigliare di sottoporsi a un test genetico.
Stabilire la capacità decisionale di un individuo: il consenso a sottoporsi a test genetici
deve derivare il più spesso possibile dai diretti interessati. Se essi sono persone di età
inferiore ai 18 anni e la richiesta di test genetico proviene dai genitori, è necessario
valutare lo sviluppo morale, le capacità cognite e decisionali del bambino/adolescente
per ottenere comunque il suo assenso. In alcuni casi, un adolescente può richiedere e
ottenere di sottoporsi a test senza il consenso dei genitori.

Linee-guida in Europa
In Europa, le linee-guida sono generiche e rimandano molte delle decisioni al singolo stato, al
singolo consultorio genetico, al singolo caso. Alcune direttive sono comunque uniformemente
applicate:

Test predittivi/di carrier su minorenni: sono diffusamente avversati o sconsigliati perché
non rispettano le regole etiche di beneficio (il bilancio rischi-benefici è considerato quasi
sempre a favore dei rischi in Europa), libertà (i minorenni non hanno totale libertà di
scelta e di azione), autonomia (è difficile stabilire se la richiesta è avvenuta senza
influenze esterne).

Test prenatali: sono consentiti solo se la coppia dichiara di voler procedere
all’interruzione della gravidanza in caso di risultato positivo (in caso contrario, ovvero se
la coppia intende comunque portare a termine la gravidanza, il test diventerebbe
predittivo).
Numerose altre sono le questioni etico-morali sollevate dalla possibilità di effettuare test
genetici su individui asintomatici, ma decisioni a riguardo sono affidate al singolo individuo.
Referenze:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Pandolfo M, Molecular pathogenesis of Friedreich ataxia, Arch Neurol 1999 Oct;56(10):1201-8
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10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
..
.. Friedreich's ataxia mutation confers cellular sensitivity to oxidant stress which
Wong A et all, The
.. of iron and calcium and inhibitors of apoptosis, Hum Molec Genet 1999,8:
is rescued by chelators
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425-30
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12
..
..
..
..
.
Expanded FRDA detection KIT
PRODUCED BY MaGiCaELa BIOTECHNOLOGIES
Coppola Eva, Sannino Maria, Tonziello Gilda, Vitiello Carmen,
Vitiello Laura.
13
..
..
..
..
.
PRESENTAZIONE DEL KIT
EXPANDED FRDA DETECTION KIT è stato ideato per ottimizzare le
tecniche di caratterizzazione molecolare degli alleli FRDA in individui
sintomatici ed asintomatici. Partendo da un prelievo di sangue di 5 ml
o da un prelievo di liquido amniotico da 15 ml, il kit permette di
rilevare la presenza di ripetizioni GAA patologiche in uno o entrambi
gli alleli FRDA. In questo modo è possibile confermare una diagnosi
clinica di FRDA, individuare soggetti carrier, predire l’insorgenza
futura della patologia in soggetti asintomatici, anche in periodo
prenatale.
EXPANDED FRDA DETECTION KIT contiene 50 test utilizzabili per:

Test FRDA diagnostico

Test FRDA predittivo

Test FRDA prenatale

Test FRDA carrier
EXPANDED FRDA DETECTION KIT prevede un’estrazione di DNA
da sangue intero in caso di test diagnostico, predittivo, carrier e da
amniociti in caso di test prenatale. A questa segue una reazione di
PCR settata per l’amplificazione della regione FRDA d’interesse, e
un’elettroforesi su gel di agarosio per osservare le dimensioni dei
prodotti di PCR ottenuti.
EXPANDED FRDA DETECTION KIT consente:

Di procedere ad una estrazione di DNA genomico da sangue intero o
amniociti mediante una procedura poco laboriosa e relativamente rapida.

Di ottenere DNA genomico in elevata quantità, ad alto grado di purezza,
pronto per essere amplificato con una reazione di PCR, scarsamente
frammentato.

Di effettuare una reazione di PCR specificamente studiata per amplificare
la regione FRDA d’interesse, di facile esecuzione poiché la maggior parte
dei materiali da utilizzare è fornita già aliquotata e pronta per l’uso.
14
..
..
..
..
controllare
.

Di
la presenza di DNA contaminante e la avvenuta
amplificazione e di alleli espansi e di alleli normali, potendo così ridurre i
casi di falsi negativi.

Di comprendere facilmente i risultati dell’elettroforesi su gel di agarosio dei
prodotti di PCR, grazie a schemi e tabelle interpretativi.
REAGENTI FORNITI
Estrazione DNA
Soluzione di lavaggio Sol A STOCK
Soluzione di lisi membrane cellulari Sol B STOCK
Soluzione di lisi membrane nucleari Flacone A + Sol C
Soluzione di precipitazione Sol D
Soluzione di risospensione Sol E
Enzimi: RNAsi Tubo a
Proteinasi K (PK) Tubo B
(Per una descrizione più dettagliata dei materiali vedere il protocollo di estrazione DNA).
Reazione di PCR ed elettroforesi:
Mix enzimatica Tubo 1
Mix reazione di PCR 1 Tubi 2
Mix reazione PCR 2 Tubi 3
Controlli amplificazione -allele espanso Tubi Con1
-allele normale Tubi Con2
-allele espanso + allele normale Tubi Con3
Markers di N° triplette Tubo 4
Colorante Tubo 5
Olio minerale Flaconi B
(Per una descrizione più dettagliata dei materiali vedere il protocollo di
PCR).
REAGENTI NON FORNITI
Estrazione DNA
15
..
..
..
..
Fenolo:Cloroformio:A.Isoamilico
in proporzione 25:24:1 saturi in H2O.
.
Etanolo 100%
Etanolo 70%
Reazione di PCR
TBE 10X: Tris108g, Acido borico 55g, EDTA 0.5M pH 7.8 4.8 ml
Agarosio: 1g per ogni elettroforesi in 100 ml TBE 1X
Bromuro di Etidio: soluzione stock a concentrazione 10 mg/ml
PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE DNA GENOMICO DA
SANGUE INTERO.
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
11)
12)
Diluire 5 ml di sangue intero (anticoagulante da usare: EDTA 1 mg/ml)
con 2 ml di Sol A DIL (200 l di Sol A STOCK1 + 1.800 ml H2O. Usare
punte rigorosamente sterili) (Tubo in polipropilene da 15 ml sterile)2.
Mescolare.
Centrifugare a 1500 rpm RT 5 min. Eliminare il sovranatante. [Raccolta
cellule ematiche].
Risospendere in 5 ml di Sol B DIL (500 l di Sol B STOCK3 + 4.500 ml
H2O. Usare punte rigorosamente sterili). Spipettare rapidamente. [Lisi
delle membrane plasmatiche, senza danneggiare i nuclei].
Centrifugare a 2000 rpm 4°C 10 min. Eliminare il sovranatante. [Raccolta
dei nuclei].
Aggiungere 250 l di FLACONE A4. Spipettare bene numerose volte.
Aggiungere 2 ml di FLACONE A in ghiaccio + 250 l di Sol C5 + 20 l PK
(Tubo a)6. Usare punte rigorosamente sterili. Spipettare. Incubare 1h a
50°C. [Lisi delle membrane nucleari. Degradazione enzimatica delle
proteine].
Aggiungere 2.5 ml di Fenolo:Cloroformio: a.Isoamilico 25:24:1 saturi
(Fase inferiore) freddi (conservati a +4°C, lontani da fonti di luce). Agitare
forte. Centrifugare a 8000 rpm 4°C 10 min. Prelevare la fase superiore.
Usare punte rigorosamente sterili. [Tappa di estrazione del DNA].
Ripetere punto 8). [Tappa di estrazione del DNA].
Aggiungere 2 l RNAsi (Tubo b)7. Usare punte rigorosamente sterili.
Incubare 1h a 37°C. [Degradazione enzimatica degli RNA].
Ripetere punto 8). [Tappa di estrazione del DNA].
Ripetere punto 8). [Tappa di estrazione del DNA].
16
13)
14)
15)
16)
..
..
..
.
Precipitare ..con 250 l Sol D8 e 6.25 ml Etanolo 100% freddo (conservato
a –20°C). Usare punte rigorosamente sterili. [Tappa di precipitazione].
Prelevare il DNA con bacchetta apposita9. Lavare in 1 ml di Etanolo 70%
freddo (conservato a –20°C). Lasciare asciugare rapidamente.
Risospendere in minimo 100 l di Sol E10. Aggiungere altri 100 l di Sol
E se il DNA non si risospende o se la soluzione è troppo vischiosa.
Usare punte rigorosamente sterili. Lasciare il DNA a +4°C il più a lungo
possibile per favorirne la risospensione. In caso di utilizzo immediato per
le successive manipolazioni, lasciare il DNA 10-15 minuti a temperatura
ambiente.
Se possibile, quantificare il DNA (lettura allo spettrofotometro a 260 e
280 nm dopo diluizione 1:10). Altrimenti si assume che, in una comune
estrazione di DNA gnomico da sangue intero, si raggiungono
concentrazioni di 200 ng/l minimo.
PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE DNA GENOMICO DA
AMNIOCITI.
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
Centrifugare 15 ml di liquido amniotico a 800 rpm 25 minuti a
temperatura ambiente. [Raccolta amniociti].
Eliminare il sovranatante, lasciandone 200 l, nei quali risospendere il
pellet. Usare punte rigorosamente sterili.
Prelevare 100 l e porre in tubo sterile da 1.5 ml. Aggiungere 300 l di
Sol B DIL (30 l Sol B STOCK3 + 270 l H2O. Usare punte
rigorosamente sterili) in ghiaccio. [Lisi delle membrane plasmatiche,
senza danneggiare i nuclei].
Vortexare. Centrifugare a 14000 rpm 5 minuti a temperatura ambiente.
Eliminare il sovranatante. Aggiungere 200 l di Sol E10. Vortexare e
centrifugare a 14000 rpm 10 minuti a temperatura ambiente. Usare
punte rigorosamente sterili.
Ripetere punto 5).
Eliminare il sovranatante. Aggiungere 100 l di FLACONE A4 + 10 l di
Sol C5 + 1 l PK (Tubo a)6. Incubare 1h a 50°C. [Lisi delle membrane
nucleari. Degradazione enzimatica delle proteine].
Aggiungere 11 l Sol D8 + 275 l di Etanolo 100% freddo (conservato a
–20°C). Centrifugare a 14000 rpm 5 minuti a temperatura ambiente.
[Tappa di precipitazione]
Eliminare il sovranatante. Aggiungere 100 l di Etanolo 70 % freddo
(conservato a –20°C). Centrifugare brevemente a temperatura ambiente.
Ripetere punto 9).
Lasciare asciugare bene il pellet.
17
12)
13)
..
..
..
..
Risospendere
. in 10 l di Sol E10.
Se possibile, quantificare il DNA (lettura allo spettrofotometro a 260 e
280 nm dopo diluizione 1:10). Altrimenti si assume che, in una comune
estrazione di DNA, si raggiungono concentrazioni di 200 ng/l minimo.
MATERIALI PER LE ESTRAZIONI DNA GENOMICO
N.B.: L’elenco seguente non verrà incluso nel Kit, ma è fornito solo al settore
produzione della MaGiCaELa Biotecnologies.
1. Sol A STOCK= 12 ml di NaCl 9% (10X). Sterile. Conservare a +4°C una volta
aperta.
2. E’ consigliato l’uso di tubi in polipropilene da 15 ml sterili. Ordinabili su
richiesta.
3. Sol B STOCK= 27 ml di NaCl 9% + NP40 5% (10X). Sterile. Conservare
a temperatura ambiente.
4. Flacone A= 120 ml di NaCl 100mM + Tris-HCl 10 mM + EDTA PH 7.8 1
mM. Sterile. Conservare a temperatura ambiente.
5. Sol C: 15 ml SDS 10%.
6. Tubo a= 1.100 ml Proteinasi K (PK) (25 mg/ml). Conservare a –20°C.
7. Tubo b= 120 
–20°C.
8. Sol D= 15 ml NaAc 3M PH 5.2. Conservare a temperatura ambiente.
9. Bacchetta in vetro sterile monouso.
10. Sol E= 25 ml TE [10 mM Tris-HCl PH 7.5 + 1 mM EDTA]. Sterile.
Conservare a temperatura ambiente.
N.B.: L’elenco seguente verrà incluso nel Kit.







Sol A STOCK: 12 ml di soluzione salina 10X. Sterile. Conservare a +4°C
una volta aperta.
Sol B STOCK= 27 ml di soluzione di lisi delle membrane cellulari 10X.
Sterile. Conservare a temperatura ambiente.
Flacone A + Sol C= soluzioni di lisi delle membrane nucleari. Sterile.
Conservare a temperatura ambiente.
Sol D= 15 ml di soluzione di NaAc per la precipitazione del DNA
genomico. Conservare a temperatura ambiente.
Sol E= 25 ml di soluzione di risospensione del DNA purificato.
Conservare a temperatura ambiente.
Tubo a= Proteinasi K per la degradazione delle proteine. Conservare a
–20°C.
Tubo b= RNAsi per la degradazione degli RNA. Conservare a –20°C.
Inventario:

4 soluzioni (A,B,C,D,E) in flaconi da 50 ml.
18



..
..
..
.
1 flaconi (A).. da 200 ml.
2 tubi da 1.5 ml (a,b) in dry ice.
50 bacchette monouso.
PROTOCOLLO DI PCR
Amplificazione del DNA di interesse
Per ogni reazione di PCR bisogna utilizzare:
1 Tubo 2 da dividere in 2 aliquote.
1 Tubo 3 da dividere in 2 aliquote.
Preparare 4 tubi per PCR da 100l come indicato:
Tubo I
48l sol Tubo 2
xl DNA per
avere 250 ng
0.75l sol Tubo 1
Tubo II
50l sol Tubo 2
No DNA
Tubo III
48l sol Tubo 3
xl DNA per
avere 250 ng
0.75l sol Tubo 1 0.75l sol Tubo 1
Tubo IV
50l sol Tubo 3
No DNA
0.75l sol Tubo 1
Coprire i tubi di reazione con 30 l Flacone B.
Amplificazione del DNA di controllo
Per ogni reazione di PCR bisogna utilizzare:
1 Tubo Con1.
1 Tubo Con2.
1 Tubo Con3.
Tubo Con1
0.75 l sol Tubo 1
Tubo Con2
0.75 l sol Tubo 1
Tubo Con3
0.75 l sol Tubo 1
Coprire i tubi di reazione con 30 l Flacone B.
N.B. utilizzare materiali (tubi, punte, ecc.) rigorosamente sterili.
Cicli di PCR
1° ciclo:
19
..
..
..
..
denaturare lo stampo
a 92-94°C per 2 minuti.
.
2°-10° ciclo:
denaturazione a 92-94°C per 10 secondi,
annealing a 62°C per 30 secondi,
elongazione a 68°C per 4 minuti.
11°-20° ciclo:
denaturazione a 92-94°C per 10 secondi,
annealing a 62°C per 30 secondi,
elongazione a 68°C per 4 minuti. La durata di questa fase va aumentata di
20 secondi per ogni ciclo.
La reazione di PCR viene condotta in un apparecchio Perkin Elmer
GenAmp 9600. Nel caso in cui vengano utilizzate apparecchiature diverse,
le condizioni dei cicli potrebbero essere modificate.
Elettroforesi dei prodotti di PCR
I prodotti di PCR vengono visualizzati mediante corsa su gel di agarosio
all’1%. Il buffer di corsa è il TBE 1 X. Sono necessari 100 ml di agarosio
all’1% (1g di agarosio in 100 ml di TBE 1X). Sia il gel, sia il buffer di corsa
devono essere colorati con bromuro di etidio, ad una concentrazione di
0.5g/ml. Quindi per 100 ml di agarosio occorrono 5l di bromuro di etidio
sol stock; mentre per 1L di TBE ne occorrono 50l. La corsa va effettuata a
110V per 3 ore. La corsa è stata testata in una camera elettroforetica
BIORAD da 100 ml. La visualizzazione delle bande va effettuata mediante
uso di un transluminatore agli UV.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER L’ELETTROFORESI
Preparare 8 tubi da 1.5 ml come sotto indicato
Lane 2
Lane 3
Lane 4
Lane 5
Lane 6
Lane 7
PM
5l tubo
Con2
2.5l sol
tubo 5
5l tubo
Con3
2.5l sol
tubo 5
2l
sol
tubo 4
2.5l sol
tubo 5
Lane 1
5l tubo I
5l tubo II 5l tuboIII 5l tuboIV 5l tubo
Con1
2.5l sol 2.5l sol 2.5l sol 2.5l sol 2.5l sol
tubo 5
tubo 5
tubo 5
tubo 5
tubo 5
20
7.5l H2O
..
..
..
.. H2O
7.5l
.
7.5l H2O 7.5l H2O 7.5l H2O 7.5l H2O 7.5l H2O 7.5l H2O
Caricare il gel in quest’ordine.
La Figura 1 sotto riportata mostra il risultato della corsa elettroforetica,
effettuata secondo le modalità riportate sopra, degli standard di peso
molecolare Tubo 4 e dei controlli Tubi Con1, Con2 e Con3.
Figura 1: Risultato della corsa elettroforetica degli standard di peso molecolare Tubo 4
e dei controlli Tubi Con1, Con2 e Con3.
La banda A rappresenta un prodotto di 520 coppie di basi (501bp + 9
triplette);
la banda B rappresenta un prodotto di 590 coppie di basi (501bp + 30
triplette);
la banda C rappresenta un prodotto di 800 coppie di basi (501bp + 100
triplette);
la banda D rappresenta un prodotto di 2000 coppie di basi (501 + 500
triplette);
la banda E rappresenta un prodotto di 3200 coppie di basi (501 + 900
triplette);
21
..
..
..
..
reazione
.
Se la
di PCR è avvenuta correttamente i controlli devono
presentare:
 lane 5 una banda di 3201 bp (501 + 3 x 900 bp)
 lane 6 una banda di 528 bp (501 + 3 x 9 bp)
 lane 7 due bande, di 528 bp e di 3201 bp
 lane 2 assenza di amplificato
 lane 4 assenza di amplificato
Se nelle lanes 5 e 7 sono assenti le bande di peso molecolare elevato
(corrispondenti agli alleli espansi), controllare che i cicli di reazione siano
stati correttamente programmati e che la preparazione dei campioni sia
stata correttamente effettuata. Se nelle lanes 2 e 4 compare un amplificato,
si è verificata una contaminazione. In tal caso, ripetere la reazione di PCR.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Se il prodotto di PCR ha dimensioni inferiori alla banda B, l’allele FRDA
viene detto normale;
se il prodotto di PCR ha dimensioni comprese tra la banda B e la banda C,
l’allele FRDA viene detto premutato;
se il prodotto di PCR ha dimensioni superiori alla banda C, l’allele FRDA
viene detto espanso.
MATERIALI PER LA REAZIONE DI PCR E
L’ELETTROFORESI DEI PRODOTTI
N.B.: L’elenco seguente verrà incluso nel Kit.
Tubo 1: 1 tubo da 1.5 ml contenente 250 l di mix enzimatica. Da
conservare a –20°C, da maneggiare con materiale sterile.
2. Tubi 2: 50 tubi da 1.5 ml ognuno contenente 100l di mix reazione di
PCR 1 + Primers 1F-1R.
Da conservare a –20°C, da maneggiare con materiale sterile.
3. Tubi 3: 50 tubi da 1.5 ml ognuno contenente 100l di mix reazione di
PCR 2 + Primers 2F-2R.
I primer utilizzati sono
Da conservare a –20°C, da maneggiare con materiale sterile.
4. Tubi Con1: 50 microtubi per PCR da 100l ognuno contenente 48l di
mix PCR2 +2l DNA per il controllo positivo dell’amplificazione dell’allele
espanso. Da conservare a –20°C, da maneggiare con materiale sterile.
5. Tubi Con2: 50 microtubi per PCR da 100l ognuno contenente 48l di
mix PCR2 +2l DNA per il controllo positivo dell’amplificazione dell’allele
normale. Da conservare a –20°C, da maneggiare con materiale sterile.
1.
22
6.
7.
8.
9.
..
..
..
.
Tubi Con3:..50 microtubi per PCR da 100l ognuno contenente 48l di
mix PCR2 +2l DNA per il controllo positivo dell’amplificazione
contemporanea dell’allele espanso e dell’allele normale. Da conservare
a –20°C, da maneggiare con materiale steril
Tubo 4: 1 tubo da 1.5 ml contenente 120 l di soluzione di markers di N°
triplette. Da conservare a –20°C, da maneggiare con materiale sterile.
Tubo 5: 1 tubo da 1.5 ml contenente 900 l di colorante.
Flacone B: 3 flaconcini contenenti 3 ml di olio minerale.
PER ULTERIORI INFORMAZIONI SUI MATERIALI UTILIZZATI NEL
PROTOCOLLO DI PCR, APRIRE FILE MOTIVAZIONI.DOC.
Inventario:





2 tubi da 1.5 ml (1,4) in dry ice
1 tubo da 1.5 ml (5)
50x2 tubi da 1.5 ml (2,3) in dry ice
50x3 microtubi per PCR (Tubi Con1,Con2,Con3) in dry ice
3 flaconi (B) da 5 ml
Guida all’interpretazione dei risultati del Kit




La colonna TIPO DI TEST indica il tipo di test utilizzato.
La colonna RISULTATI PCR va consultata per comprendere i risultati
della reazione di PCR seguita da elettroforesi su gel di agarosio.
La colonna INTERPRETAZIONE va consultata per interpretare i risultati
derivanti da ogni singolo campione preso in esame.
Le percentuali riportate in colonna ERRORE indicano la probabilità di
errore su uno specifico risultato che si commette trascurando di prendere
in esame rari eventi (mutazioni puntiformi) riportati in letteratura, che
possono comunque causare FA (vedi paragrafo CONSIDERAZIONI
EPIDEMIOLOGICHE nella relazione generale). Alla percentuale d’errore
dello 0.06% (frequenza di presenza di una mutazione puntiforme in un
allele normale nei carriers) va aggiunta la probabilità di errore
sperimentale derivante dalla mancata amplificazione durante la reazione
di PCR di un allele espanso (calcolabile sperimentalmente) e la
probabilità, in caso di alleli normali con un numero di repeats pari a 3240, di essere di fronte a un caso di premutazione (evento raro).
PER CONSULTARE LA TABELLA INTERPRETATIVA APRIRE FILE
INTERPRETAZIONE.DOC
23
..
..
..
..
.
VALUTAZIONE SUI TEMPI E SUI COSTI
Tempi:
Il risultato del test diagnostico, predittivo, prenatale o di carrier viene consegnato,
usando EXPANDED FRDA DETECTION KIT, 2 giorni dopo il prelievo di sangue o di
liquido amniotico.
Costi:
EXPANDED FRDA DETECTION KIT per 50 test ha un costo approssimativo di £
900.000.
AREE DI RICERCA
La MaGiCaELa BIOTECHNOLOGIES si propone di avviare diversi settori di ricerca al
fine di migliorare o perfezionare EXPANDED FRDA DETECTION KIT. In particolare
sono stati finanziati i seguenti indirizzi di ricerca:




Testare kit di estrazione di DNA genomico da sangue o amniociti, già in
commercio o di neoproduzione ad opera della stessa MaGiCaELa
BIOTECHNOLOGIES, che presentino, come requisiti fondamentali, la
elevata purezza, quantità, amplificabilità e la mancata frammentazione
del DNA estratto.
Caratterizzare le regioni fiancheggianti il siti di espansione delle triplette
GAA nell’introne 1 del gene FRDA. Infatti il loro polimorfismo è spesso
causa della mancata amplificazione degli alleli FRDA durante PCR, a
causa dell’assente annealing dei primers. Per questo motivo risulta
necessario eseguire la PCR in presenza di almeno 2 set di primers
diversi. Evidenziando regioni fiancheggianti particolarmente conservate
nella popolazione si potrebbe effettuare PCR con una singola coppia di
primers, con notevoli vantaggi e per gli utenti e per i produttori.
Verificare l’errore sperimentale intrinseco ai protocolli di estrazione,
amplificazione, elettroforesi e interpretazione: l’azienda si propone di
usare EXPANDED FRDA DETECTION KIT un numero elevato di volte
(200) su campioni già tipizzati per calcolare con metodi statistici le
probabilità di errore direttamente imputabile alle metodiche presenti o ai
criteri interpretativi suggeriti dal Kit.
Valutare l’impatto sul mercato soprattutto dei Test di carrier, per
sviluppare, qualora la richiesta giustifichi i costi, metodiche di
determinazione del numero preciso dei repeats degli alleli normali,
valore di notevole interesse ma attualmente ottenibile con procedure
complesse e costose.
24
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