Dalla comparsa delle prime macromolecole e dalla

Malondialdeide (MDA): marcatore di stress ossidativo
Gizzi S.,Rossi R.,Mourvaki E., Ercolani E. and Rufini S.
Dip. Medicina Clinica e Sperimentale
Università degli Studi di Perugia
INTRODUZIONE
Dalla comparsa delle prime macromolecole e dalla loro organizzazione in sistemi più
complessi a dare le prime forme di vita, è iniziato subito il rapporto e il confronto con i diversi
fattori ambientali dotati di capacità lesive.
In particolare le ricerche sperimentali e cliniche condotte negli ultimi anni hanno messo in
evidenza come l’esposizione di cellule, tessuti o organismi in toto, ai RADICALI LIBERI e alle
SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO (ROS) sia in grado di provocare gravi e sostanziali
modificazioni nel metabolismo, nella struttura e nel funzionamento cellulare.
Tali modificazioni non sempre portano a un vero danno in senso tossico, come la morte
cellulare, l’arresto o il rallentamento della crescita o della replicazione cellulare; in alcuni casi
è stato osservato un potenziamento dell’attività replicativa, interpretabile come la prima fase
di un potenziale processo di cancerogenesi.
In condizioni normali, tuttavia, il potenziale tossico delle specie reattive prodotte è
neutralizzato da un complesso sistema di fattori antiossidanti, che rappresenta il meccanismo
di difesa fisiologico endogeno.
Il rapporto fra fattori pro-ossidanti e difese antiossidanti rappresenta la cosiddetta “Bilancia
Ossidativa”.
BILANCIA OSSIDATIVA =
Fattori pro-ossidanti (farmaci, tossici attivi,
radiazioni,
variazioni tensione di O2, flogosi)
------------------------------------------------------1°Barriera antiossidante (SOD, catalasi, GSH- perossidasi)
2°Barriera antiossidante (vitamine A, C, E, GSH);
Carotenoidi : e-carotene, licopene, -criptoxantina,
luteina/zeaxantina, apigenina, naringenina.
Lo STRESS OSSIDATIVO è l’espressione biologica di un danno che si verifica quando i
fattori pro-ossidanti superano le difese antiossidanti. L’equilibrio esistente in condizioni
fisiologiche può essere turbato sia da fattori che potenziano la produzione di specie reattive
dell’ossigeno, sia da fattori che riducono l’attività dei sistemi di difesa antiossidanti
dell’organismo.
I radicali liberi sono atomi o molecole che, per la presenza di un elettrone spaiato nel
proprio orbitale esterno, sono altamente instabili; reagiscono velocemente con molecole
sensibili, poste nelle vicinanze della sede in cui vengono prodotti, per acquistare o
cedere elettroni, e le danneggiano irreversibilmente, causando danni ai tessuti, con
necrosi o apoptosi. Sono in grado, così, di modificare il metabolismo, ma sono anche
ritenuti la principale causa del precoce invecchiamento cellulare e di varie patologie.
La rilevanza di questo fenomeno ha fatto si che venissero studiate e messe a punto tutta
una serie di analisi su campioni biologici in grado di dimostrare la presenza di un danno
ossidativo ed eventualmente di definirne l’entità. Tra i primi ad essere accettato
universalmente è stato il dosaggio della malondialdeide.
La Malondialdeide (MDA) è un marker dello stato perossidato dei tessuti biologici, causato da
stress endogeno o esogeno, in seguito ad esposizione al perossido di idrogeno.
La perossidazione lipidica porta a degradazione delle membrane plasmatiche, con
conseguenze patologiche come l’aterosclerosi, l’invecchiamento cellulare, ma anche
l’insorgenza di cancro e di malattie cardiovascolari ed epatiche.
Un iniziatore della perossidazione lipidica, oltre ad altre ROS, è il radicale idrossilico, il quale
sottrae un atomo di H a livello dei doppi legami presenti negli acidi grassi polinsaturi dei
fosfolipidi di membrana, e porta così alla formazione di idroperossidi lipidici; la rottura di tali
idroperossidi produce una serie di aldeidi, tra cui la Malondialdeide.
H
H
C
O
C
H
H
C
O
Uno dei metodi di valutazione della perossidazione lipidica fa riferimento proprio alla
rilevazione di questi prodotti finali di trasformazione come la malondialdeide che può essere
facilmente evidenziata mediante il saggio dell’acido tiobarbiturico (TBA). Quindi, dopo
l’iniziazione e la propagazione della perossidazione lipidica nelle membrane biologiche,
l’integrità strutturale e funzionale delle membrane viene perduta a causa dell’aumento della
permeabilità e dell’inattivazione di enzimi di membrana.
Come effetto secondario della perossidazione lipidica, i prodotti formatisi possono innescare
nuove reazioni radicaliche. Per esempio, gli idroperossidi lipidici possono diffondere dalla
membrana della cellula o possono attraversare la membrana plasmatica, ed essere
trasportati nella circolazione sanguigna. Questi idroperossidi possono quindi iniziare nuove
reazioni radicaliche in sedi diverse, dando luogo a idroperossidi lipidici molto diversi da quelli
originali. Anche i prodotti di degradazione della perossidazione lipidica sono altamente
citotossici e hanno loro stessi un determinato effetto biologico.
Il nostro contributo a questo studio è stato quello di mettere a punto un nuovo sistema per il
dosaggio della MDA che fosse in grado di dosare la sola malondialdeide, separandola da tutti
gli altri prodotti presenti nel citoplasma che, potendo reagire con l’acido tiobarbiturico, danno
luogo ad una serie di errori che hanno reso molto spesso inaccettabili i risultati di questa
analisi .
MATERIALI E METODI
I livelli di MDA nel plasma sono stati determinati utilizzando una cromatografia liquida ad alta
risoluzione ( HPLC). Il metodo è stato applicato a tutti i campioni senza alcun procedimento di
estrazione.
Il metodo consiste in una cromatografia in fase inversa con condizioni isocratiche.
Le condizioni cromatografiche per ottenere una migliore separazione del marker sono state
raggiunte utilizzando come fase mobile una soluzione composta da 35% di metanolo e 65%
di tampone fosfato di sodio ( 50 mM) a pH 7 e una colonna C18 in fase inversa.
I campioni sono stati preparati aggiungendo a 50 microL di plasma:
 10 microL di acido tiobarbiturico (TBA) al 0,2% sciolto in tampone Na-acetato contenente
1 mM di acido dietilentriamminopentacetico (DTPA) pH 3,5
 10 microL di 2,6-di-ter-butil-4-metilfenolo (BHT) al 5% sciolto in etanolo al 96%. BHT e
DTPA sono stabilizzanti essenziali per la formazione del complesso MDA-TBA.
 Il tutto è mescolato in vortex e messo a 95°C per 45’.
Successivamente il campione è stato raffreddato a temperatura ambiente, quindi centrifugato
a 10.000 giri per 5’.
Il complesso MDA-TBA è stato eluito in HPLC con un flusso di 1 ml / min e monitorato in
fluorescenza ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 515 nm e di emissione a 553 nm
Fig. 1. Cromatogramma caratteristico dell’ MDA (picco 1)
RISULTATI
In media i livelli di MDA nel plasma del gruppo di volontari è risultato di 0.3 micromol/L con
coefficiente di variazione di dirca 58 % Non si è evidenziata una differenza statistica tra i
soggetti di sesso maschile e femminile né una correlazione con l’età. Abbiamo quindi esteso
questo studio ad un ristretto numero ( 34) di soggetti in condizione basali e dopo essersi
sottoposti a trattamento con Seqex device (endogen cyclotronic resonance) per 20 giorni. Si
evince una significativa diminuzione di concentrazione di MDA immediatamente dopo
trattamento ( in media 0.6 microml/L prima e 0.2 microml/Ldopo trattamento).
MDA1 :concentrazione di MDA prima trattamento con Seqex device (endogen cyclotronic
resonance)
MDA2: concentrazione di MDA immediatamente dopo trattamento Seqex device (endogen
cyclotronic resonance)
MDA 3 : concentrazione di MDA dopo 20 giorni di trattamento con Seqex device (endogen
cyclotronic resonance)
Univariate Bar Chart
,9
,8
,7
+1 SD (MDA1)
Va riables
,6
,5
MDA1
,4
Mean (MDA1)
+1 SD (MDA2)
,3
,2
MDA2
Mean (MDA2)
(MDA1)
-1 SD (MDA2)
,1
0
-,1
Observations
Univariate Bar Chart
,9
,8
,7
+1
+1 SD
SD (MDA1)
(MDA3)
Va riables
,6
,5
MDA1
,4
Mean (MDA3)
(MDA1)
,3
,2
-1 SD (MDA3)
-1 SD (MDA1)
,1
0
-,1
Observations
MDA3