Oncogene
Funzione
nella cellula normale
Cancro
Oncogeni
Protooncogene
H-ras
c-erbB
c-myc
c-fos
c-kit
c-raf
RAR-
E6
MDM2
cicline
CDK2;4
funzione normale
Alterazioni nel cancro
Tumori associati
ONCOGENI -> agiscono in maniera dominante; sono causa di forme
sporadiche di tumori
-Fattori di crescita (GF)
-Recettori dei fattori di crescita
-Componenti della trasduzione del segnale intracellulare (ras)
-Fattori di trascrizione (myc)
-Regolatori del ciclo cellulare (cicline)
Meccanismi di attivazione degli oncogeni
Differenti tipi di alterazioni genomiche possono avere effetti
oncogeni.
-Amplificazione genica
-Mutazioni puntiformi
-Creazione di geni chimerici (traslocazione 9; 22), come BCR-ABL
-Traslocazione di geni in regioni cromosomiche trascrizionalmente attive (mycIGH)
Oltre alle proteine necessarie per l ’ attivazione della
proliferazione cellulare, del ciclo di divisione e dell’apoptosi ce
ne sono altre che controllano le proteine attivatrici e ce ne
sono ancora altre che sono necessarie a riparare eventuali
danni a carico del DNA genomico e contribuire così a
prevenire il cancro (ANTIONCOGENI).
ANTIONCOGENI
Nel determinare lo sviluppo di un tumore, oltre agli oncogeni possono essere
coinvolti geni che specificano proteine che LIMITANO la proliferazione cellulare
incontrollata ed i cicli di divisione
GENI SOPPRESSORI DEL TUMORE o TSG
(sono responsabili sia di forme sporadiche dei
tumori che di forme ereditarie)
Nei casi di tumore ereditario, in cui sono coinvolti questi geni, un individuo
erediterà un allele mutante che inattiva questo tipo di gene che quindi
“predispone al tumore” un’alterazione che interviene poi in una cellula
somatica nell’allele “sano” rende la cellula omozigote per la mancanza
della funzione di quel gene che determinerà quindi una crescita non più
regolata della cellula in cui questa alterazione è insorta
Si parla in questo caso di “ perdita di eterozigosità” (LOH)
Si può avere la trasformazione cellulare sia per attivazione di un
ONCOGENE che per la perdita di funzione di un ANTIONCOGENE
Forma sempre attiva anche
senza segnali esterni (via della
trasduzione del segnale)
Ras inattiva
GAP
NF-1
Ras attiva
Ci sono inoltre altre
proteine che regolano
Ras come NF-1 e GAP
(se
queste
non
funzionano ras rimane
attiva);
queste
si
comportano
come
ANTIONCOGENI
L’oncoproteina Ras resta
bloccata nello stato attivo
se c’è la mutazione e il
segnale diventa continuo
È attivata una serina/treonina chinasi a
valle
L ’ interazione
con
SOS
stimola
lo
scambio GDPGTP
Tumori familiari ed ereditari
Circa il 5% di tutti i casi di cancro sono EREDITARI: in questi casi svolge un
ruolo decisivo una mutazione germinale
Si definisce cancro familiare un tipo di cancro che colpisce numerosi membri
di una stessa famiglia e non è necessariamente ereditario
Il cancro ereditario invece è un tipo di cancro la cui predisposizione è
geneticamente trasmessa e che potrebbe anche essere familiare.
Altre sindromi cancerose EREDITARIE
Sindrome
cancerosa
Cancro primario
Posizione
cromosomica
Designazione
del gene
Funzione normale
del prodotto genico
HNPCC
Continua……………….
Sindrome cancerosa
Cancro primario
Posizione
cromosomica
Designazione
del gene
Funzione normale
del prodotto genico
Albero genealogico di una famiglia con cancro colorettale ereditario
non poliposico ( HNPCC)
Cancro al colon
Altri tipi di tumori
Diagnosi non certa
C -> cancro al colon
S -> cancro allo stomaco
E -> cancro all’endometrio
P -> cancro al pancreas
B -> cancro al tratto urinario
Si definiscono famiglie con HNPCC quelle famiglie in cui almeno tre consanguinei
su due generazioni hanno avuto una diagnosi di cancro al colon, uno dei quali con
diagnosi ad un’età inferiore ai 50 anni
Ipotesi per l’insorgenza dei tumori ereditari
È ipotizzabile che attraverso la linea germinale di un individuo si possa
ereditare una predisposizione al tumore
In questo caso sono interessati geni recessivi che
negativamente la crescita cellulare ( gli ANTIONCOGENI)
controllano
Un esempio di questo tipo di tumore ereditario è fornito dal
RETINOBLASTOMA
Di questo tipo di tumore se ne conosce una forma ereditaria (che di solito è
BILATERALE) ed anche una forma sporadica (che è UNILATERALE)
IPOTESI DI KNUDSON:
Nella forma familiare si erediterebbe un allele mutato dell’antioncogene
(Rb) e si avrebbe una seconda mutazione per varie cause ( una forma di
perdita di eterozigosità).
La predisposizione al tumore è DOMINANTE e lo sviluppo del tumore è
recessivo
Alberi genealogici per il retinoblastoma
EREDITARIO (di solito è bilaterale)
SPORADICO (di solito è unilaterale)
Dimostrazione dell’ ipotesi di Knudson
Rari bambini con retinoblastoma bilaterale mostravano anche altri gravi
difetti e ritardo mentale
Citologicamente questi bambini mostravano una delezione nel braccio
lungo del cromosoma 13 nella regione 13q14 (regione minima deleta >SRO)
Mappatura del gene del retinoblastoma
p
SRO
q
Dimostrazione dell’ ipotesi di Knudson
Rari bambini con retinoblastoma bilaterale mostravano anche altri gravi
difetti e ritardo mentale
Citologicamente questi bambini mostravano una delezione nel braccio
lungo del cromosoma 13 nella regione 13q14 (regione minima deleta >SRO)
In questa regione mappa l’esterasi D che è un enzima costitutivo; si è
quindi effettuata un’analisi di linkage con l’esterasi D
È stata effettuata l’analisi dell’attività enzimatica dell’esterasi D
Nei casi di RETINOBLASTOMA EREDITARIO l’attività dell’esterasi D
risulta di 0,5 rispetto a quella di un individuo normale nel sangue
dell’individuo che mostra il tumore nella retina ed è ridotta a 0 nelle cellule
tumorali (della retina) -> si è avuta la PERDITA’ DI ETEROZIGOSITA’.
Nei casi di RETINOBLASTOMA SPORADICO nel sangue degli individui
affetti l’attività enzimatica dell’esterasi D è pari ad 1, mentre nelle cellule
tumorali della retina è pari a 0
Ipotesi di Knudson
Retinoblastoma EREDITARIO
X
X
X
Retinoblastoma NON EREDITARIO
Occasionalmente in una
cellula
della
retina
avviene una mutazione
a livello del gene Rb
Gene mutato per Rb
XX
X
X
Occasionalmente in una
cellula
della
retina
avviene una SECONDA
mutazione a livello del
gene Rb
Si
ha
quindi una
proliferazione
incontrollata di questa
cellula che risulta nella
formazione
del
retinoblastoma
(BIILATERALE)
La maggior parte degli individui che
ereditano Rb-1 in eterozigosi
sviluppano il tumore
X X
La seconda copia del
gene è molto raramente
inattivatta
nella
STESSA cellula
Si ha
quindi una
proliferazione
incontrollata di questa
cellula che risulta nella
formazione
del
retinoblastoma
(UNILATERALE)
Solo in 1/30000 persone si sviluppa
questo
tipo
di
tumore
spontaneamente
Retinoblastoma familiare
Retinoblastoma sporadico
Strategia per il clonaggio del gene del retinoblastoma
5kb
Chromosome jumping
Esterasi-D
Rb-1 (1,5 kb)
Northern su
RNA da retina
5kb
cDNA di Rb-1
1kb
R
180 kb -> 17 esoni mRNA 3000 nt
R
B
B
R
Proteina pRB
1
928
Serina
252*
Treonina
249*
608
356 373*
788
795
821
811*
612
807*
La proteina è di 928 amminoacidi,è ricca di prolina e glicina e controlla il ciclo cellulare
(passaggio dalla fase G1 alla fase S)
Nel nucleo, durante la fase G1, pRB
interagisce proprio con un fattore di
trascrizione E2F e lo INATTIVA.
Quando la cellula passa da G1 alla fase S,
si forma un complesso CDK4/ciclina D1,
questo complesso FOSFORILA pRB e
quindi a seguito della fosforilazione E2F
viene
rilasciato e diventa ATTIVO
trascrizionalmente.
La fosforilazione di pRB è transitoria;
appena i complessi CDK/ciclina sono
degradati e la cellula si muove attraverso il
ciclo cellulare alla fase G1 iniziale, la
fosforilazione di pRB decade.
Meccanismi per la perdita di eterozigosità (LOH)
Genotipo eterozigote per Rb-1
Genotipi delle cellule della retina di questo individuo prive della funzione Rb
Genotipo omozigote per Rb-1 per
SECONDA MUTAZIONE
Genotipo omozigote per Rb-1 per
PERDITA CROMOSOMICA oppure
PERDITA CROMOSOMICA + NON
DISGIUNZIONE
Genotipo per DELEZIONE che
manifesta fenotipo Rb-1
Genotipo omozigote per Rb-1 per
RICOMBINAZIONE MITOTICA
Conclusioni 1
I geni coinvolti nell’insorgenza dei tumori sono raggruppati in due grandi categorie:
ONCOGENI -> geni che controllano la proliferazione cellulare, la progressione
attraverso il ciclo cellulare e l’apoptosi
La maggior parte di questi geni se mutati (anche in una sola copia) possono determinare
l’insorgenza del tumore (Mutazioni Dominanti)
ANTIONCOGENI -> geni che regolano i geni coinvolti nella proliferazione cellulare, la
progressione attraverso il ciclo cellulare e l’apoptosi
Per l’induzione dei tumori da parte di questi geni è necessario che entrambe le copie del
gene (sui due cromosomi omologhi) siano mutate (Mutazioni recessive, necessitano della
perdita dell’eterozigosità.
Per i tumori ereditari questo si può realizzare in un unico passaggio in quanto si eradita già
una copia mutata del gene, nei tumori sporadici la cellula prima deve diventare eterozigote
per la mutazione e poi deve acquistare la perdita dell’eterozigosità
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
•Comparative genomic hybridization (CGH) is a fluorescent molecular cytogenetic technique
that identifies DNA gains and losses, mapping these variations to normal metaphase
chromosomes.
•It is a powerful tool for screening chromosomal copy number changes in tumor genomes
and has the advantage of analyzing entire genomes within a single experiment.
•It is particularly applicable to the study of tumors which do not yield sufficient metaphases
for cytogenetic analysis and can be applied to fresh or frozen tissues, cell lines, and archival
formalin-fixed paraffin-embedded samples.
CGH is based on quantitative two-color fluorescence in situ hybridization.
Equal amounts of differentially labeled tumor genomic DNA and normal reference DNA are
mixed together and hybridized under conditions of Cot-1 DNA suppression to normal
metaphase spreads.
The labeled probes are detected with two different fluorochromes, e.g., FITC o CY3 for tumor
DNA and TRITC o CY5 for the normal DNA. The difference in fluorescence Intensities along the
chromosomes in the reference metaphase spread are a reflection of the copy number
changes of corresponding sequences in the tumor DNA.
DNA da
testare
DAPI
FITC
TRITC
DAPI, FITC, TRITC superposition
CGH has the advantage of requiring only genomic tumor DNA, making it highly useful for cancer cytogenetics,
circumventing the need for high quality tumor metaphase spreads.
The ability to study archival material allows retrospective analysis which can correlate chromosomal aberrations
with the clinical course.
Since its introduction in 1992, CGH has been applied to a broad variety of tumor types which have previously
defied comprehensive cytogenetic analysis by traditional methods. CGH has, for example:
•
Revealed consistent genetic imbalances and multiple amplification sites in carcinomas of the brain, colon,
prostate, cervix, and breast. For instance: it identified chromosome 7 gain and chromosome 10 loss as
landmark aberrations in glioblastomas, and specific gains of chromosomes 1, 8, 17, and 20 and loss of 13q
and 17p in breast cancer.
•
Found chromosomal aberrations in human leukemia, lymphoma, and solid tumors has identified non-random
tumor and tumor-stage specific genetic changes. This information can guide positional cloning efforts.
•
Become an important initial screening test for chromosomal gains and losses in solid tumor progression, and
the results derived from these experiments can be applied to the development of more specific diagnostics.
array-CGH
Extract, amplify and label DNA
CGH
Hybridize to metaphase
spread on BAC array
Array-CGH
greatly improves the resolution of the CGH technique by substituting the
hybridization target, the metaphase chromosome spread, with genomic segments spotted in
an array format.
Resolution of the techinque:
•traditional CGH : 10 Mb
•array-CGH: 75-135 kb
DNA da
testare
General principles of array comparative genomic hybridization. (a) Normal and tumour DNA samples are
isolated and used to create fluorescently labelled probes (FITC and TRITC). The probes are pooled and
competitively cohybridized to a glass slide spotted with a known array of mapped genomic clones (BAC or
PAC clones). The arrays are analysed with a microarray scanner, producing an image that is used to assess
the ratios of the FITC to TRITC intensities for each clone. (b) A ratio profile is assembled to determine
relative copy number changes between the reference and tumour samples. Each dot on the graph
represents a clone. Values to the left of the ‘0’ line indicate a loss of a genomic region, values to the right
indicate a gain or amplification, and values at ‘0’ indicate no change.
Whole-genome profile of a cell lung cancer sample. Each dot represents a BAC clone and is visualized using
SeeGH software. Clones around the centre line indicate normal regions in the tumour genome in relation to
the normal reference sample. Clones to the left of centre represent homozygous or hemizygous deletions in
the tumour, whereas clones to the right represent gains and amplifications. Focal amplifications of common
oncogenes are magnified.
