la regolazione genica nei procarioti
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Dott. Fabio Picciolo VIII ciclo silsis A060 Anno 2007/8 LA REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI Tipologia di istituto: classe III liceo scientifico Lezioni della prof.ssa Marina Marini Modulo didattico: genetica molecolare dei procarioti Durata: 2 ore Prerequisiti Dai moduli precedenti: • Struttura chimica degli acidi nucleici • Struttura delle proteine • Concetto di enzima • Concetto di gene Dallo stesso modulo: • Il codice genetico • Sintesi proteica (trascrizione e traduzione) CONCETTI FONDAMENTALI • • • • • • Operone Geni inducubili Geni reprimibili Regolazione negativa Regolazione positiva Significato adattativo della regolazione genica I ORA NON TUTTI I GENI VENGONO UTILIZZATI NELLO STESSO MOMENTO E NON TUTTI CON LA STESSA “INTENSITÀ” Regolazione genica = la modalità con cui viene REGOLATA la tipologia e la quantità dei prodotti genici Prodotto genico = RNA e/o proteina (in ultima analisi) Regolazione Genica nei Procarioti Finalità: Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali Logica: Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non servano subito Base fisiologica: la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente pochi geni sono regolati, ognuno con il suo meccanismo individuale, di induzione o di repressione I geni strutturali dei batteri sono organizzati in “cluster” : gruppi di geni codificanti per proteine con funzioni correlate, (es. enzimi di una stessa via metabolica, proteine deputate al trasporto intracellulare ecc), che si trovano sotto il dominio di un unico promotore. OPERONE Unità di trascrizione descritta nel 1961 da François Jacob e Jacques Monod, che per questo furono insigniti del premio Nobel. L’unità completa include: • Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse • Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina repressore • Promotore: Sito sul DNA cui si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle Schema generale dell’operone Sono proteine RNA polimerasi Promotore La capacità dell’RNA polimerasi di iniziare la trascrizione dipende dall’assenza di impedimenti a livello del promotore; possono essere presenti dei repressori che impediscono l’inizio della trascrizione. Si parla di regolazione negativa Repressore Operatore Gene 1 Gene 2 Sono sequenze di DNA Gene 3 Il repressore inattivo non si lega all’operatore. La RNA polimerasi può eseguire la trascrizione. Repressore Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Gene 3 Proteina 1 Proteina 2 Proteina 3 N.B.: il sito operatore non viene trascritto e non codifica per nessuna proteina Il repressore attivo si lega all’operatore. La RNA polimerasi NON può eseguire la trascrizione. Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Gene 3 Da dove viene il repressore ? • La trascrizione dei geni strutturali è spesso controllata dall’attività di un altro gene, detto REGOLATORE • Il gene regolatore codifica per la proteina repressore, che si lega in maniera specifica all’operatore di un operone • Il gene regolatore può trovarsi in qualsiasi punto del DNA batterico, non necessariamente adiacente all’operone RNA polimerasi Regolatore Promotore Repressore Operatore Geni Facciamo un esempio: Escherichia Coli Per trasformare l’ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi, codificati da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac) Per sintetizzare il TRIPTOFANO servono cinque enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso operone (trp) Operone lattosio (lac) Operone triptofano (trp) Geni inducibili Geni reprimibili DOMANDA CHIAVE Cosa permette al repressore di attaccarsi o meno al sito operatore ? Effettore E’ una molecola che si lega in maniera specifica al repressore. Questo legame può rendere attivo o inattivo il repressore. Si lega all’operatore Trascrizione impedita Trascrizione impedita Si lega all’operatore Operone lac: Induttore Repressore inattivo Si tratta di una VIA CATABOLICA, normalmente inattiva (non espressa), che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da degradare (il lattosio) OPERONE TRP: Repressore inattivo Corepressore + repressore Si tratta di una VIA ANABOLICA, normalmente attiva (espressa), che viene inattivata o REPRESSA dalla presenza della molecola (il triptofano) che si forma per effetto delle attività enzimatiche. In base all’effetto che il complesso EFFETTORE-REPRESSORE produce sulla trascrizione si possono distinguere: • geni inducibili • geni reprimibili Ora sapreste darne una definizione? COMPITO OPERONI INDUCIBILI Esempio di operone Esempio di effettore Complesso effettorerepressore Ruolo dell’effettore Definizione dell’effettore In presenza del substrato OPERONI REPRIMIBILI II ORA RIEPILOGO I ORA CORREZIONE COMPITO OPERONI INDUCIBILI OPERONI REPRIMIBILI Esempio di operone Operone del lattosio (lac) Operone del triptofano (trp) Esempio di effettore Allolattosio Triptofano Complesso effettorerepressore Inattivo, si stacca dal sito operatore Attivo, si aggancia al sito operatore Ruolo dell’effettore Disattiva il repressore, quindi può avvenire la trascrizione. Attiva il repressore, quindi NON può avvenire la trascrizione. Definizione dell’effettore INDUTTORE COREPRESSORE In presenza del substrato Viene avviata la sintesi proteica Viene inibita la sintesi proteica Regolazione della trascrizione di secondo livello In genere per una buona attivazione del gene non è sufficiente che l’RNA polimerasi non abbia impedimenti a iniziare la trascrizione, perché spesso il promotore è poco efficiente. È necessario anche che una o più proteine favoriscano la trascrizione. Si parla quindi di regolazione positiva. Nella regolazione negativa, un repressore, legandosi al sito operatore in prossimità del promotore, impedisce la trascrizione dei geni strutturali Nella regolazione positiva, una o più proteine, legandosi nel sito attivatore favoriscono la trascrizione dei geni strutturali favorendo l’attacco della RNA polimerasi Proteina attivatore RNA polimerasi Promotore Operatore Geni Alcuni sistemi coinvolgono regolatori positivi. L’operone lattosio presenta sia elementi di controllo negativi che positivi. La proteina di attivazione si lega alla sequenza di basi adiacente al sito promotore, consentendo alla RNA polimerasi di legarsi efficientemente e quindi attivare la trascrizione dell’operone. Analogamente a quanto ci siamo chiesti per i repressori nella regolazione negativa, ora dobbiamo chiederci… Nella regolazione positiva cosa permette alla proteina attivatore di attaccarsi o meno al sito attivatore ? Il controllo positivo dell’operone lattosio necessita che la cellula avverta l’assenza del glucosio. In assenza di glucosio non può avvenire la glicolisi e si accumula cAMP. Questo accumulo rappresenta il segnale biochimico che deve favorire (attivare) la trascrizione dell’operone lac. + Proteina CAP inattiva 2 cAMP Proteina CAP attiva La proteina CAP attiva si lega al sito attivatore e favorisce l’aggancio della RNA polimerasi al sito promotore. La trascrizione dell’operone lac viene incentivata. Ovviamente è necessario che, pur in carenza di glucosio, ci sia del lattosio disponibile. Sapreste dire perché ? La regolazione del lac-operon avviene a due livelli la carenza di glucosio induce la sintesi di cAMP e l’attivazione di CAP In assenza di lattosio da metabolizzare Il repressore dell’operone lac impedisce la trascrizione 1° livello: Il repressore Lac opera una regolazione negativa; l’operone è inducibile. 2° livello: Il complesso cAMP-CAP opera una regolazione positiva, inducendo livelli di trascrizione più alti. Ora dovrebbero essere più chiari questi concetti legati alla regolazione genica nei procarioti Finalità: Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali Logica: Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non servano subito Base fisiologica: la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente pochi geni sono regolati, ognuno con il suo meccanismo individuale, di induzione o di repressione La regolazione positiva favorisce la trascrizione. La regione del promotore cui si lega cAMP-CAP è diversa da quella cui si lega la polimerasi Le regioni del lac operon che legano le proteine di regolazione La proteina CAP “sforza” l’elica, ripiegandola. In tal modo favorisce l’inizio della trascrizione a partire dal vicino promotore A volte i regolatori si legano a sequenze poste ad una certa distanza dal promotore; in tal caso, esse interagiscono con la polimerasi grazie alla formazione di un ansa del DNA. Qui è schematizzata una regolazione positiva. La regolazione “di secondo livello” può utilizzare lo stesso attivatore per regolare più operoni. Ad esempio, gli operoni che controllano l’utilizzo di zuccheri diversi dal glucosio sono controllati dai singoli zuccheri per quanto riguarda la regolazione negativa (gli zuccheri inducono la trascrizione rimuovendo il repressore), ma sono regolati tutti dal complesso cAMP-CAP per quanto riguarda la regolazione positiva. CAP si lega al sito attivatore solo se complessata a cAMP, che, a sua volta, viene sintetizzato in caso di carenza di glucosio. Il repressore Trp è un omodimero con simmetria speculare; le due subunità riconoscono tratti quasi identici posti su eliche complementari (palindrome) Il sito di legame di un regolatore omodimerico, come il repressore Trp, è una sequenza palindromica; le due subunità del regolatore dovranno quindi disporsi con una simmetria speculare Il repressore lac è anch’esso un dimero; si lega a due siti distanti tra loro, distorcendo l’elica in modo tale da impedire il legame con l’RNA polimerasi L’ansa formata dal repressore lac 4- Regolazione co-trascrizionale Si tratta di una modalità di regolazione per la quale la trascrizione di un gene, già iniziata, viene terminata precocemente, dando luogo ad un breve RNA, il cui prodotto non sarà funzionale. Per comprendere questa modalità di regolazione, è necessario comprendere come viene attuata la TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE. Infatti, questa modalità di regolazione sfrutta gli stessi meccanismi della terminazione “rho-indipendente”. Due modalità per la terminazione della trascrizione nei procarioti Dettaglio della terminazione rho-dipendente Il segnale di terminazione è normalmente costituito da un’ansa dell’RNA ricca di G-C e seguita da AUUUU L’operone Trp e la regolazione genica cotraduzionale per attenuazione Solo se il livello intracellulare di triptofano è scarso si ha la trascrizione completa dell’mRNA Per comprendere il meccanismo della regolazione co-traduzionale mediato da attenuazione è necessario ricordare che nei procarioti la traduzione (= sintesi proteica, operata dai ribosomi) ha inizio mentre l’mRNA è ancora in corso di trascrizione. La velocità della sintesi proteica, inoltre, può essere influenzata dalla scarsità di un determinato amminoacil-tRNA. Il meccanismo dell’attenuazione fa sì la sintesi dell’mRNA dell’operone Trp venga completata solo se il Trp-tRNA è scarso. Questa regione “leader” dell’mRNA del I gene strutturale dell’operone Trp è ricca di triplette codificanti per Trp; il ribosoma, che inizia a tradurre dalla tripletta AUG, si troverà in stallo se non ha a disposizione sufficiente Trp-tRNA. Se il livello di triptofano è basso, il ribosoma rallenta e non copre la regione 2 dell’mRNA in tempo per evitare che essa interagisca con la regione 3 che nel frattempo viene sintetizzata; le regioni 2 e 3 , accoppiate, formano un complesso di terminazione. Questo NON è un complesso di terminazione Questo è un complesso di terminazione Il tRNA procariotico viene modificato dopo la sua sintesi, che genera un precursore di grandi dimensioni. I procarioti hanno un’unica DNA polimerasi per la sintesi di tutte le classi di RNA. L’RNA ribosomiale dei procarioti viene sintetizzato come un’unica molecola; il precursore viene tagliato e metilato per originare i tre rRNA maturi Un semplice sistema di trasduzione del segnale nei procarioti regola i geni che rispondono alla carenza di fosfati Controllo dell’espressione genica • ENZIMI COSTITUTIVI • ENZIMI INDUCIBILI Operone lattosio lac (operone inducibile) Operone lac (operone inducibile) Altre modalità di controllo dell’operone lac Glucosio AMP cAMP= AMP ciclico CAP= PROTEINA ATTIVATRICE DEL CATABOLITA Operone triptofano (operone repressibile) Operone triptofano Altre modalità di controllo dell’operone triptofano Operone triptofano Attenuazione ATTENUAZIONE Assenza di triptofano: la trascrizione dell’operone va avanti Assenza di triptofano: la sequenza Leader non viene tradotta, ma la trascrizione dei geni per il triptofano può continuare Attenuazione Eccesso di triptofano: la trascrizione dell’operone si arresta Eccesso di triptofano:la sequenza Leader viene tradotta, ma il processo di trascrizione dei geni per il triptofano si arresta Altre modalità di controllo dell’espressione genica Sistemi a due componenti Segnali ambientali Proteina sensore Proteina risposta Attivazione dell’espressione genica in rapporto alla densità di popolazione microbica: QUORUM SENSING Modalità di controllo dell’espressione genica nei batteri 1. Attraverso i fattori sigma 2. Controllo delle funzioni degli operoni 3. Sistemi a due componenti 4. Comunicazioni inter-cellulari (quorum sensing)
