Enzimi
“Proteine che agiscono da
catalizzatori
biologici
aumentando enormemente la
velocità
delle
reazioni
biochimiche”
PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI
Alta specificità dotati
di elevatissimo grado di specificità,
maggiore di qualunque catalizzatore chimico
Alta velocità di reazione aumentano
reazione
enzimi
fino a 1012
la velocità di
volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da
Capacità di regolazione inibizione
a feedback, controllo
allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima
Agiscono in condizioni moderate temperature
inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro
Catalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione
senza produrre sottoprodotti indesiderati
Sintesi proteica
Zimogeno
(precursore)
Apoenzima
(parte proteica)
gruppo prostetico
(legato covalentemente
OLOENZIMA
Apoenzima
(inattivo)
ione metallico
coenzima (vitamina)
Coenzimi
Coenzima
Precursore
Biocitina
Biotina
5‘-Deossiadenosilcobalamina
Vitamina B12
Flavin adenin dinucleotide
Riboflavina (B2)
Acido lipoico
Acido lipoico
Nicotinamide adenin dinucleotide
Ac. Nicotinico
Piridossal fosfato
Piridossina (B6)
Tetraidrofolato
Folato
Tiamin pirofosfato
Tiamina (B1)
Elementi inorganici che servono
come cofattori di enzimi
Cu2+
Citocromo ossidasi
Fe2+ o Fe 3+
Catalasi, perossidasi
K+
Piruvato cinasi
Mg2+
Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi
Mn2+
Arginasi
Mo
Dinitrogenasi
Ni2+
Ureasi
Se
Glutatione perossidasi
Zn2+
Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi
Velocità delle reazioni
X+Y
Z
La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo
l’equazione di Arrehenius:
Velocità = Ae - Ea/RT
Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata
alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento
ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia
sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di
attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1K-1) e T la
temperatura assoluta
La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P
si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma
la reazione non può avvenire se S non acquisisce
sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di
attivazione
Energia
Stato di
transizione
S
ENERGIA DI
ATTIVAZIONE
Ea
P
Coordinte di reazione
Come agiscono gli enzimi?
Si combinano transientemente con il substrato e ne
abbassano l’energia di attivazione
Non spostano l’equilibrio della reazione, ma
aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene
raggiunto
Non subiscono modificazioni permanenti durante la
reazione e sono subito disponibili per catalizzare una
nuovo ciclo di reazione
Distribuzione delle energie
cinetiche
Numero di molecole
Molecole con valori medi di
energia
Molecole che possiedono energia
sufficiente per reagire in una
reazione catalizzata da un enzima
Molecole
che
possiedono
energia sufficiente per reagire
in
una
reazione
non
catalizzata
Energia cinetica delle molecole
Reazione non catalizzata
S
P
Reazione catalizzata da un enzima
E+S
ES
EP
E+ P
Profilo energetico di una reazione
catalizzata da un enzima
Stato di transizione
Energia
Eatt (non enzimatica)
Stato di
transizione
Eatt (enzimatica)
E+S
Stato di
transizione
ΔG°
ES
E+P
EP
Coordinate di reazione
Misura dell’attività enzimatica
Mi permette di determinare la quantità
di enzima presente in un campione
Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima
di catalizzare una reazione
Supponiamo di voler determinare la quantità di
Lattico deidrogenasi (LDH) presente nel sangue di
un paziente
LDH
Lattato + NAD+
Piruvato + NADH
ABS
340 nm
NADH
NAD+
Lunghezza d’onda
Preparazione test
Tampone
Substrato
Miscela
tampone-substrato
Cuvetta (quarzovetro-plastica)
Scelta della lunghezza d’onda
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
START
STOP
Spettrofotometro
340 nm
0.000
ABS
2.000
Lunghezza d’onda
1.000
0.000
0
1
minuti
2
Spettrofotometro
Posizionamento della
cuvetta nello
spettrofotometro
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato)
Rapido
mescolamento
ABS
340 nm
1.546
2.000
1.000
0.000
0
1
2
minuti
Inizia la reazione enzimatica
ABS
340 nm
1.516
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.493
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.479
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.449
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.411
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.390
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.343
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.317
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.289
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.274
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.245
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.224
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.189
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.156
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.123
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.098
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.053
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
1.012
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.994
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.964
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.938
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.910
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.889
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.868
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.861
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.844
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.821
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.803
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.789
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.777
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.759
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.719
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.690
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.657
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.634
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.611
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.592
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.558
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.528
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.499
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.459
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.425
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.399
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.384
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
ABS
340 nm
0.380
2.000
1.000
0.000
0
1
2
minuti
La registrazione viene bloccata
Determinazione dell’attività enzimatica
ABS
340 nm
0.380
2.000
1.000
0.000
0
1
minuti
2
Occorre calcolare la velocità della reazione
Se vengono rispettate determinate
condizioni, la velocità della reazione è
direttamente proporzionale alla
concentrazione di enzima
?
In condizioni di stato stazionario
k1
E+S
k1 >> k2
k1 ≥ k3
k2
ES
k3
E+P
Velocità= k3[ES]
se la concentrazione di substrato è
sufficientemente elevata
[E] [ES]
In condizioni di stato stazionario
k1
E+S
k1 >> k2
k1 ≥ k3
k2
ES
k3
E+P
Fino a quando
[E] >>[S]
V = costante
V = k3[ES] [E]
Andamento della velocità iniziale in funzione
della concentrazione di substrato
Vo
V max
•
•
•
•
•
•
• • •
•
•
•
••
L’equazione matematica che
esprime la relazione iperbolica
tra la velocità iniziale e la
concentrazione del substrato
viene detta equazione di
Michaelis-Menten
½ Vmax
v=
Km
[S]
Vmax [S]
Km [S]
Determinazione dell’attività enzimatica
ABS
340 nm
2.000
1.000
0.380
Pendenza
A/min
0.000
0
1
minuti
2
Determinazione dell’attività enzimatica
ABS
340 nm
2.000
1.000
0.380
Velocità
costante
0.000
0
1
minuti
2
In condizioni di [S] saturanti
ABS
340 nm
0.380
2.000
1.000
La velocità della
reazione non aumenta
all’aumentare della
concentrazione di
substrato
0.000
0
1
2
minuti
In tali condizioni la velocità è direttamente
proporzionale alla concentrazione di enzima
Determinazione dell’attività
enzimatica
Variazione di
assorbimento
Unità
enzimatiche
UI =
Coefficiente di
estinzione (mM o M)
del substrato
Volume totale test
A Vtot
d
Cammino
ottico
t
Vc
Tempo
Volume
enzima
L’attività di un enzima viene misurata in termini
di “Unità enzimatiche” o “Unità Internazionali”
“Unità enzimatica”
Quantità di enzima capace di
trasformare una micromole (mole) di
substrato in un minuto per ml di
soluzione
In condizioni di [S] saturanti
Velocità
1 unità di enzima
2 unità di enzima
3 unità di enzima
Tempo
Incrementando la concentrazione di
enzima aumenta la pendenza della retta
Metodi
Continuo
L’operatore segue la reazione
“in tempo reale”: è possibile
capire se stiamo eseguendo
effettivamente una misura di
velocità iniziale la velocità
enzimatica
deve
rimanere
costante. In tali condizioni la
velocità di reazione risulta
direttamente proporzionale alla
concentrazione dell’enzima da
misurare
A tempo fisso
L’operatore fa partire la
reazione e la blocca dopo
un periodo di incubazione
prescelto è essenziale che
durante tale periodo la
reazione sia di ordine zero
relativamente
alla
concentrazione
del
substrato e la velocità
enzimatica
sia
quindi
sempre massima
ABS
ABS
Continuo
v0
Tempo
v0
Tempo
ABS
Problemi di
mescolamento, effetto
diluizione….
Soluzione concentrata di
enzima
v0
Tempo
A tempo fisso
v0
ABS
ABS
STOP
STOP
v0
Tempo
Tempo
STOP
Elevata concentrazione di
enzima
v0
Tempo
Campione non mescolato,
precipitato…..
Tipologia di analisi
Test semplice:
Test accoppiato:
Nella soluzione di reazione è
presente un solo enzima. La
reazione può essere seguita
monitorizzando la scomparsa del
substrato, la formazione del
prodotto,
le
variazioni
spettroscopiche
di
qualche
coenzima (NADH, NADPH per
esempio)
Si rende necessario quando
nessuno dei composti che
prendono parte o si formano nella
reazione enzimatica può essere
sfruttato per seguire l’andamento
della
reazione.
Occorre
accoppiare la reazione “primaria”
con una seconda reazione definita
“indicatrice”
Test ottico semplice
(test di Warburg)
deidrogenasi
A + NADH + H+
B + NAD+
ABS
340 nm
NADH o NADPH
NAD+ o NADP+
Lunghezza d’onda
Test ottico accoppiato
A+B
enzima
C+D
deidrogenasi
D + NADH + H+
E + NAD+
creatinfosfocinasi
Creatinfosfato+ ADP
Acido piruvico + ATP
esocinasi
Glucosio + ATP
Glucosio-6-P + NADP+
Glucosio-6-P
deidrogenasi
Glucosio-6-P + ADP
Acido lattico + NADPH + H+
Per effettuare un dosaggio enzimatico in
maniera corretta occorre:
Uniformare la temperatura (30°C)
Scegliere il valore di pH ottimale
Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)
