Enzimi A
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Enzimi “Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche” PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI Alta specificità dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico Alta velocità di reazione aumentano reazione enzimi fino a 1012 la velocità di volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da Capacità di regolazione inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima Agiscono in condizioni moderate temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro Catalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati Sintesi proteica Zimogeno (precursore) Apoenzima (parte proteica) gruppo prostetico (legato covalentemente OLOENZIMA Apoenzima (inattivo) ione metallico coenzima (vitamina) Coenzimi Coenzima Precursore Biocitina Biotina 5‘-Deossiadenosilcobalamina Vitamina B12 Flavin adenin dinucleotide Riboflavina (B2) Acido lipoico Acido lipoico Nicotinamide adenin dinucleotide Ac. Nicotinico Piridossal fosfato Piridossina (B6) Tetraidrofolato Folato Tiamin pirofosfato Tiamina (B1) Elementi inorganici che servono come cofattori di enzimi Cu2+ Citocromo ossidasi Fe2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi K+ Piruvato cinasi Mg2+ Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi Mn2+ Arginasi Mo Dinitrogenasi Ni2+ Ureasi Se Glutatione perossidasi Zn2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi Velocità delle reazioni X+Y Z La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius: Velocità = Ae - Ea/RT Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1K-1) e T la temperatura assoluta La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione Energia Stato di transizione S ENERGIA DI ATTIVAZIONE Ea P Coordinte di reazione Come agiscono gli enzimi? Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione Distribuzione delle energie cinetiche Numero di molecole Molecole con valori medi di energia Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione catalizzata da un enzima Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata Energia cinetica delle molecole Reazione non catalizzata S P Reazione catalizzata da un enzima E+S ES EP E+ P Profilo energetico di una reazione catalizzata da un enzima Stato di transizione Energia Eatt (non enzimatica) Stato di transizione Eatt (enzimatica) E+S Stato di transizione ΔG° ES E+P EP Coordinate di reazione Misura dell’attività enzimatica Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un campione Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) presente nel sangue di un paziente LDH Lattato + NAD+ Piruvato + NADH ABS 340 nm NADH NAD+ Lunghezza d’onda Preparazione test Tampone Substrato Miscela tampone-substrato Cuvetta (quarzovetro-plastica) Scelta della lunghezza d’onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 START STOP Spettrofotometro 340 nm 0.000 ABS 2.000 Lunghezza d’onda 1.000 0.000 0 1 minuti 2 Spettrofotometro Posizionamento della cuvetta nello spettrofotometro ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato) Rapido mescolamento ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 0 1 2 minuti Inizia la reazione enzimatica ABS 340 nm 1.516 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.493 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.479 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.449 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.411 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.390 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.343 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.317 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.289 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.274 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.245 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.224 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.189 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.156 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.123 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.098 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.053 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 1.012 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.994 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.964 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.938 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.910 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.889 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.868 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.861 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.844 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.821 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.803 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.789 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.777 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.759 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.719 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.690 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.657 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.634 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.611 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.592 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.558 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.528 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.499 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.459 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.425 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.399 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.384 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 ABS 340 nm 0.380 2.000 1.000 0.000 0 1 2 minuti La registrazione viene bloccata Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 0.380 2.000 1.000 0.000 0 1 minuti 2 Occorre calcolare la velocità della reazione Se vengono rispettate determinate condizioni, la velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima ? In condizioni di stato stazionario k1 E+S k1 >> k2 k1 ≥ k3 k2 ES k3 E+P Velocità= k3[ES] se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevata [E] [ES] In condizioni di stato stazionario k1 E+S k1 >> k2 k1 ≥ k3 k2 ES k3 E+P Fino a quando [E] >>[S] V = costante V = k3[ES] [E] Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di substrato Vo V max • • • • • • • • • • • • •• L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten ½ Vmax v= Km [S] Vmax [S] Km [S] Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 2.000 1.000 0.380 Pendenza A/min 0.000 0 1 minuti 2 Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 2.000 1.000 0.380 Velocità costante 0.000 0 1 minuti 2 In condizioni di [S] saturanti ABS 340 nm 0.380 2.000 1.000 La velocità della reazione non aumenta all’aumentare della concentrazione di substrato 0.000 0 1 2 minuti In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima Determinazione dell’attività enzimatica Variazione di assorbimento Unità enzimatiche UI = Coefficiente di estinzione (mM o M) del substrato Volume totale test A Vtot d Cammino ottico t Vc Tempo Volume enzima L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità Internazionali” “Unità enzimatica” Quantità di enzima capace di trasformare una micromole (mole) di substrato in un minuto per ml di soluzione In condizioni di [S] saturanti Velocità 1 unità di enzima 2 unità di enzima 3 unità di enzima Tempo Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della retta Metodi Continuo L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di velocità iniziale la velocità enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da misurare A tempo fisso L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione prescelto è essenziale che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero relativamente alla concentrazione del substrato e la velocità enzimatica sia quindi sempre massima ABS ABS Continuo v0 Tempo v0 Tempo ABS Problemi di mescolamento, effetto diluizione…. Soluzione concentrata di enzima v0 Tempo A tempo fisso v0 ABS ABS STOP STOP v0 Tempo Tempo STOP Elevata concentrazione di enzima v0 Tempo Campione non mescolato, precipitato….. Tipologia di analisi Test semplice: Test accoppiato: Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per esempio) Si rende necessario quando nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita “indicatrice” Test ottico semplice (test di Warburg) deidrogenasi A + NADH + H+ B + NAD+ ABS 340 nm NADH o NADPH NAD+ o NADP+ Lunghezza d’onda Test ottico accoppiato A+B enzima C+D deidrogenasi D + NADH + H+ E + NAD+ creatinfosfocinasi Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATP esocinasi Glucosio + ATP Glucosio-6-P + NADP+ Glucosio-6-P deidrogenasi Glucosio-6-P + ADP Acido lattico + NADPH + H+ Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre: Uniformare la temperatura (30°C) Scegliere il valore di pH ottimale Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)
