Presentazione di PowerPoint

NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Review: tecniche di rivelazione di attività
elettrica neuronale
Jacopo Lotti
Laboratorio Europeo di Spettroscopia Non-lineare
Università di Firenze
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Neurone e Impulso
INPUT
dendriti
Impulso elettrico
corpo cellulare
(soma o pirenoforo)
assone
sinapsi
OUTPUT
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Letteratura: alcune funzioni note
L'attività elettrica spontanea dei neuroni nel SNC regola molti
processi fondamentali di sviluppo del sistema nervoso, tra cui:
 migrazione neuronale (Komuro & Rakic, 1992, 1998),
 escrescenza degli assoni (Gu et al.. 1994; Catalano & Shatz, 1998),
 selezione del fenotipo del trasmettitore (Gu et al., 1994),
 modellamento dendritico (Wong & Ghosh, 2002),
 attivazione dei recettori del trasmettitore (Liao et al., 2001),
 protrusione sinaptica (Shatz & Stryker, 1988; O'Leary et al., 1994),
 espressione di, liberazione di, e ricettività alle neurotrofine (Blochl & Thoenen, 1995;
Meyer-Franke et al., 1998; Shieh & Ghosh, 1999),
 apoptosi (morte cellulare programmata) (Svoboda ed altri. 2001),
 sviluppo di tipologie di canale ionico maturi (Desarmenien & Spitzer, 1991; Linsdell &
Moody, 1994, 1995; Dallman et al., 1998; Grosse et al., 2000).
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Comunicazione e Codificazione
Neuroni: comunicano tra loro con “linguaggio”
elettro-chimico tramite le sinapsi
Sinapsi: aree circoscritte deputate
alla trasmissione unidirezionale
dell’informazione nervosa
Informazione: codificata in termini di
transienti di attività elettrica chiamati
Potenziali d’Azione (inglese “spikes”).
Meccanismo di azione: ON / OFF
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Stimolo: Dove e Quando
Collocazione spaziale: area cerebrale interessata
colore rosso
Occhio:
retina e nervo ottico
Dominio temporale: frequenza di firing
tempo
Quali e quanti neuroni? Sincronie tra neuroni?
Pathway dello stimolo? Ripetizione dello stesso pathway?
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Stato dell’arte
Microelettrodi
Ottica
• Patch-clamp
• Micro electrode array (MEA)
• Elettroencefalografia (EEG)
• EEG intracranica (iEEG)
• Lineare:
- Singolo-fotone
• Non-lineare:
- Due-fotoni
- Generazione Seconda Armonica (SHG)
Elettromagnetica (?)
• Magnetoencefalografia (MEG)
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
MICROELETTRODI
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Patch-clamp
Permette di studiare le correnti ioniche cellulari trans-membranarie, cioè le variazioni di conduttanza della
membrana cellulare  potenziali d’azione.
Pipetta di vetro con
microelettrodo all’interno
Tecnica: isolare elettricamente un’area piccolissima (patch) di membrana, e registrare le correnti ioniche che fluiscono
attraverso i canali ionici presenti.
Il potenziale in uscita è proporzionale alla corrente applicata all’ingresso invertente (-), cioè alla corrente che passa nel patch
di membrana isolato dalla bocca dell’elettrodo.
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Patch-clamp
CONFIGURAZIONI:
Cell-attached: registrazione
delle correnti di pochi o
singoli canali.
Whole-cell: registrarzione delle
correnti ioniche che
attraversano tutta la membrana
Grafico di potenziali di membrana indotti tramite
patch-clamp in configurazione whole-cell (voltageclamp)
Ogni linea colorata corrisponde al potenziale di membrana
raggiunto da una cellula del Purkinje con un “holding
potential” di –70 mV in seguito all’induzione di transienti
elettrici ad amperaggio crescente. In alto a sinistra, tabella
con i rispettivi valori di elettricità indotta ad ogni ripetizione.
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Patch-clamp
Applicazioni
• Registrazioni molto accurate in singola cellula (extra- e intracellulari)
• Difficilmente estendibile a:
- più di due cellule per volta
- cellule molto vicine
- diverse aree della stessa cellula contemporaneamente
• Ottimo per esperimenti in vitro
• Ottimo, ma invasivo, in vivo
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Micro-electrode array (MEA)
MEA chip commerciale (Ayanda Biosystems SA):
camera di registrazione (circolare) circondata da 60
microelettrodi che confluiscono nell’area centale della
camera di registrazione (retina).
Particolare centrale della retina: vi confluiscono 60
microelettrodi disposti ordinatamente in un’area di 800
m2; la distanza tra due elettrodi adiacenti è di 100m.
(www.ayanda-biosys.com/mea_biochips.html)
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Micro-electrode array (MEA)
Registrazione MEA: profilo laminare ippocampo
area CA1.
A) Fettina di ippocampo spessa 350 μm posizionata su
800 × 800 MEA.
Elettrodo rosso: stimolazione fibre collaterali.
Elettrodi gialli: elettrodi allineati in parallelo ai dendriti
apicali di neuroni piramidali in area CA1. Registrazione
risposta sinaptica in vari strati.
Linea verde: strato corpi cellulari.
Distanza tra gli elettrodi: 100 μm.
B) Grafico attività eccitatoria registrata dagli elettrodi gialli
(da 1 a 5) in risposta ad un transiente elettrico applicato
all’elettrodo di stimolazione.
Kopanitsa et al., BMC Neuroscience 2006, 7: 61
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Micro-electrode array (MEA)
Applicazioni
• Registrare attività di campo
• Esperimenti in vitro o ex vivo (fette acute di tessuto)
• Difficilmente estendibile in vivo
• Impossibile registrare attività con risoluzione di singola cellula
Singolo
corpo cell
8 - 20m
100m
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Elettroencefalografia (EEG)
Registra attività ritmica e transienti elettrici encefalici
Attività elettrica: corrente post-sinaptica (la corrente
extracellulare genera il voltaggio) registrata tramite elettrodi
posizionati sullo scalpo. Rivela la somma dell’attività sincrona
di migliaia di neuroni aventi simile orientamento spaziale,
perpendicolare rispetto allo scalpo
Attività ritmica: è divisa in bande di frequenza (onde alfa,
beta, gamma, delta e teta).
Applicazioni
Benefici:
- non invasiva
- non necessita collaborazione del soggetto esaminato
Limiti:
- risoluzione temporale dell’ordine del millisecondo
- scarsa risoluzione spaziale
- sensibilità selettiva:
> strati superficiali della corteccia, sulle creste (radiali allo
scalpo)
< dendriti in profondità o producenti corrente tangenziale
allo scalpo
- oscuramento sorgente intracranica: meningi, liquor
cerebrospinale
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
EEG intracranica (iEEG)
Si inseriscono elettrodi nel cranio, nei pressi della
superficie encefalica, sotto la superficie della
dura. Ciò avviene in seguito ad una craniotomia.
Questa tecnica prende varie denominazioni: EEG
intracranica (iEEG), elettrocorticografia (ECoG) e
EEG subdurale (sdEEG).
Gli elettrodi possono anche essere inseriti in
strutture encefaliche profonde (amigdala,
ippocampo etc), aree non facilmente accessibili
tramite EEG convenzionale.
Il segnale elettrocorticale è processato nello
stesso modo dell’EEG, tramite una coppia di
cavetti
(A)
MRI strutturale. Posizione elettrodi 8x8 cm.
In rosso: elettrodo 55.
(B)
ECoG: risposta dell’elettrodo 55 (tempo-frequenza)
Rosso: alta potenza
Blu: bassa potenza
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
OTTICA
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Coloranti voltaggio-sensibili (VSD)
Le molecole di VSD si intercalano perpendicolarmente alla
membrana plasmatica. Durante un potenziale d’azione,
tali molecole si dispongono parallelamente al campo
elettrico indotto.
intensità segnale emesso  intensità transiente elettrico
(Peter Baker, Dept. of Biology, Arizona State University).
• Risoluzione temporale: fino a ~ 0,1 ms
• Risoluzione spaziale: fino ad 1 m ; dipende dal tipo di microscopia ottica combinata
• Tossicità: da moderata ad elevata
• Tempo di vita: da 10 min ad alcune ore
• Applicazioni: in vivo ed in vitro, ma non sull’uomo
• Vantaggi principali: indicano “dove” e “quando”; indagine non invasiva
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Microscopia Lineare e Non-lineare
Non-lineare
Lineare
Eccitazione elettronica (spettro del visibile):
•
Lineare = interazione 1 fotone ad alta energia + 1 elettrone
•
Non-lineare = interazione simultanea 2 fotoni a bassa energia + 1 elettrone
 alta probabilità spazio – temporale di interazione
Fluorescenza
Non-lineare  dipende in maniera non-lineare dalla densità fotonica:
L- eccitazione del mezzo nei coni superiore ed inferiore rispetto al fuoco
N- confinamento spaziale del volume di eccitazione nella regione focale
piano
focale
L- elevato scattering (diffusione luminosa nel mezzo)
N- scattering estremamente ridotto
Comunemente l’assorbimento non-lineare di sonde fluorescenti avviene nello
spettro dell’infrarosso (  700 - 1000 nm):
N- maggiore capacità di penetrazione nel tessuto e minore foto-danneggiamento
tissutale (rispetto ad L)
Microscopia Non-lineare = Risoluzione Micrometrica in Profondità nei Tessuti
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Microscopia Lineare e Non-lineare
IMAGING
LINEARE
IN VITRO:
• molti neuroni simultaneamente;
• assenza di vincoli spaziali;
• buona risoluzione della singola cellula in vitro
o in sezioni estremamente superficiali di tessuto
IN VIVO:
diffusione della luce in profondità in tessuti intatti inomogenei (es.: in
vivo ed ex vivo)  degradazione irreversibile della risoluzione
spaziale
NON-LINEARE
2-PE
SHG
(Fluorescenza ad
Eccitazione a due-fotoni)
(Generazione di
Seconda Armonica)
INCOERENTE
COERENTE
IN VITRO :
• molti neuroni simultaneamente;
• assenza di vincoli spaziali;
• ottima risoluzione della singola
cellula
IN VIVO:
NO diffusione di luce in profondità in
tessuti intatti inomogenei (es.: in
vivo ed ex vivo)  ottima
risoluzione spaziale (micrometrica)
IN VITRO e EX VIVO:
• molti neuroni simultaneamente;
• assenza di vincoli spaziali;
• ottima risoluzione delle
membrana della singola cellula
IN VIVO:
IMPOSSIBILE:
quasi
totalità del segnale è
direzionale in “forward
scattering”
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Generazione di Seconda Armonica (SHG)
NON-LINEARE: Interazione simultanea 2 fotoni a bassa energia + 1 elettrone
NO Fluorescenza: Interazione simultanea (NO assorbimento / emissione):
“trasferimento” di energia totale ed immediato
IMAGING
SHG: Coerente
Molecole orientate casualmente Psegnale  N
Molecole allineate: Psegnale  N 2
Neuroni di Aplysia in coltura.
(Sacconi et al., 2006)
2-PE: Incoerente
Molecole orientate casualmente
e allineate: Psegnale  N
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Registrazione SHG di Potenziali d’Azione
Misura dell’attività elettrica lungo un neurite di
Aplysia mediante registrazione SHG da varie
posizioni dello stesso neurone
(Sacconi et al., 2006)
(Sacconi et al., 2006)
RASH Microscopy :
(a)
Sezione sagittale di cervelletto,
profondità 90m
(b) Attività elettrica simultanea di 5
cellule del Purkinje
(c) Sovrapposizione tracce (b):
studio sincronie
(Sacconi et al., 2008)
(Dombeck et al., 2005)
(Sacconi et al., 2008)
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
ELETTROMAGNETICA (?)
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Magnetoencefalografia (MEG)
• Non invasiva: non richiede né iniezioni di isotopi né esposizioni a raggi-X
• Misura campi magnetici generati dall’attività neuronale: misura diretta delle funzioni cerebrali
• Complementare ad imaging anatomico (es. risonanza magnetica)
• Risoluzione temporale: 1 ms
• Risoluzione spaziale: 1mm
Attività neuronale: campi magnetici sono situati ovunque ci sia un passaggio di corrente
ELETTRICA, sia in un filo sia in una cellula nervosa…
Si misura l’attività di campo e non della singola cellula
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Magnetoencefalografia (MEG)
• Il campo magnetico passa inalterato attravarso il
tessuto cerebrale e le ossa del cranio: può essere
registrato fuori dalla testa
• Il campo magnetico è estremamente piccolo:
viene rivelato da sofisticati sensori basati sulla
superconduttività (SQUID)
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Magnetoencefalografia (MEG)
Analizzando la distribuzione spaziale del
campo magnetico, usando come modello un
singolo dipolo, è possibile stimare la
localizzazione intracranica della sorgente
generatrice e sovrapporla ad un Imaging in
Risomanza Magnetica (MRI)
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Conclusioni
• In generale, il numero delle unità funzionali che formano una rete neuronale (il numero di cellule
interrogate) è inversamente proporzionale alla specificità del segnale raccolto dalle singole unità funzionali:
Patch-clamp e 1-PE (in vitro): una sola cellula (o al massimo due nel patch-clamp)  attività altamente
caratterizzata
MEA, EEG e MEG: molte cellule  visione di un’attività media di gruppo
• Microscopio RASH (ex vivo), o un RA 2-PE (anche in vivo!)  è possibile superare tale limite studiando
l’attività elettrica di gruppi di neuroni mantenendo l’acquisizione di dati al livello delle singole cellule
NJC, Febbraio 2009
Neuroscience Journal Club
Grazie dell’attenzione