Biologia - Dispensa lezione 3

Trascrizione nei procarioti e negli
eucarioti
Regolazione dell’espressione genica
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Trascrizione
Processo mediante il quale
l’informazione contenuta in
una
sequenza
di
DNA
(gene) viene copiata in una
sequenza complementare di
RNA
dall’enzima
RNA
polimerasi
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Solo una frazione del genoma viene trascritta, quella CODIFICANTE,
organizzata in unità funzionali dette GENI
Trend evolutivo:
con l’aumentare delle dimensioni del genoma, aumenta la frazione
non codificante
coding
non coding
100
80
60
6X
4300 geni
40
<25000 geni
20
0
E.coli
dimensioni:
4,7
S.cerevisiae
12,1
C.elegans
100
Human
700X
3300 Mb
3
Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi sequenze non codificanti
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non
codificanti
Gene 1
Gene 2
Gene 3
4
DNA non codificante 1



< 2% del nostro genoma è rappresentato da sequenze
esoniche
Più del 98% del genoma umano è composto da
sequenze non codificanti proteine
26% del genoma umano è rappresentato da regioni
introniche e sequenze regolatrici
Sequenze regolatrici
DNA non codificante 2

44%
del
genoma
umano
è
rappresentato
da
retrotrasposoni (elementi in grado di copiarsi e poi di
integrarsi in altre posizioni del genoma) (8% sono
sequenze di origine retrovirale)

Geni per RNA non codificanti proteine (rRNA, tRNA,
RNA coinvolti nella regolazione della trascrizione genica
o nell’ inattivazione cromosoma X)

Pseudogeni (c.a. 20.000 sequenze simili a geni ma non
più funzionanti)
6
Pseudogeni
L’inattivazione non ha
effetti negativi perché
rimane
la
copia
originaria del gene
Il gene duplicato può
accumulare mutazioni che
fanno assumere nuove
funzioni
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Trascrizione
gene
Filamento stampo
(coding strand)
8
Geni posti sullo stesso cromosoma possono
avere come “coding strand” filamenti
diversi del DNA
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Visione d’insieme della trascrizione
10
Inizio della trascrizione
la RNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza del promotore
e “copia” il filamento di DNA stampo a partire dal sito di inizio
della trascrizione
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Il promotore
è una sequenza specifica del DNA che viene riconosciuta dalla RNA
polimerasi e determina DOVE la sintesi del mRNA inizia e
QUALE filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo.
Promotore procariotico
Sito di inizio della
denaturazione
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Allungamento della catena dell’RNA
G
C
C G CU
GA
CC TC
I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può essere copiato. La RNA polimerasi,
a differenza della DNA polimerasi, non ha bisogno di un innesco
Procarioti: RNA polimerasi si lega direttamente al promotore
Eucarioti: fattori di trascrizione proteici legano il promotore prima dell’ RNA
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polimerasi II
Allungamento della catena dell’RNA
A differenza delle DNA polimerasi, le RNA polimerasi non
hanno attività “proof reading”
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DNA mutato
Tutte le molecole di RNA
portano la mutazione
trascrizione
DNA wt
Errore
della RNA
polimerasi
Una sola molecole di RNA
porta la mutazione
Allungamento della catena dell’RNA
3’
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Terminazione
Sequenze specifiche sul DNA (terminator) determinano l’arresto della
trascrizione in corrispondenza di un determinato nucleotide (STOP site)
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Alfa amanitina inibisce le RNA pol eucariotiche
Polipeptide biciclico
L'avvelenamento con le amanitine è caratterizzato da un lungo periodo di latenza (dalle 6 alle
48 ore, in media 6-15 ore) durante il quale il paziente non accusa alcun sintomo.
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Nei procarioti il trascritto viene subito tradotto in proteina …
20
…
nel nucleo delle cellule eucariotiche invece avviene un complicato
processo di MATURAZIONE prima che il trascritto venga esportato
nel citoplasma e tradotto.
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Dal nucleo al citoplasma
pori nucleari
linfocita visto
al M.E. dopo
criofrattura
Dal nucleo dove avviene la trascrizione, gli RNA messaggeri maturi
passano attraverso i pori nucleari nel citoplasma, dove vengono
tradotti
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Nei geni degli eucarioti le
sequenze codificanti per
proteine (esoni) sono
interrotte da sequenze non
codificanti (introni).
Il trascritto primario, prima di
abbandonare il nucleo, viene
sottoposto ad un processo
di taglio e ricucitura
(splicing):
gli introni vengono eliminati
e gli esoni riuniti uno all’altro.
La molecola di mRNA
maturo che esce dal nucleo
sarà costituita da una sequenza
codificante continua
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Splicing alternativo
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Splicing alternativo
Il fenomeno dello SPLICING alternativo negli eucarioti
aumenta il potenziale espressivo del genoma.
E’ la regola, non l’eccezione
Mediante forme di splicing alternativo da uno stesso gene
possono derivare trascritti diversi che, una volta tradotti,
danno luogo a proteine diverse
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Potenziale espressivo in H. sapiens
In H. sapiens si stima che la percentuale di geni che
subiscono splicing alternativo sia >90% (Hallegger M
et al., 2010)
N° geni H. sapiens : 20-25000
18-22000 geni subiscono AS
Il numero medio di varianti di splicing prodotto da
ciascuno di questi geni è 4 (Kim H et al., 2004)
La stima del numero di proteine prodotte è di 7288000
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Splicing alternativo dell’ mRNA per la tropomiosina
(5 isoforme)
Tropomiosina: proteina che lega l’actina (coinvolta nella contrazione muscolare)
e fa parte delle proteine del citoscheletro nelle cellule non muscolari
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Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…..
Nei procarioti più geni possono essere trascritti in un unico mRNA
mRNA policistronico
permeasi
enzimi che digeriscono il lattosio
Regolazione coordinata dell’espressione genica:
geni che codificano per proteine coinvolte nella stessa via metabolica
(es metabolismo del lattosio) vengono trascritti contemporaneamente
poiché sono sulla stessa molecola di mRNA
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Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…..
Negli eucarioti sempre 1 mRNA = 1 gene
Stabilizzazione mRNA
Legame al ribosoma
Stabilizzazione mRNA
Esportazione mRNA dal
nucleo
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Modificazioni post-trascrizionali del messaggero
mRNA eucariotico
trascrizione + splicing
traduzione
UnTranslated Region
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Regolazione dell’espressione genica
Solo alcuni geni vengono costituzionalmente trascritti per ogni cellula (geni
housekeeping: enzimi del metabolismo, RNA polimerasi, ribosomi, istoni…)
Per tutti gli altri esistono molti meccanismi che permettono di regolare se,
quando (meccanismi di regolazione temporali) e quanto un gene deve essere
trascritto
Ciò è particolarmente evidente e importante negli organismi eucarioti
multicellulari dove esiste una regolazione tessuto specifica (cellule diverse
producono proteine diverse)
Anche nei procarioti tuttavia vi sono meccanismi di regolazione
dell’espressione genica OPERONI
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cardiomiocita
neurone
epatociti
Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti
Il pattern di geni espressi per ogni tipo cellulare è diverso
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Potenziali punti di controllo
dell’espressione genica
In primo luogo la conformazione
della cromatina condiziona la
trascrizione (cromatina addensata =
trascrizionalmente inattiva)
EUCARIOTI
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Potenziali punti di controllo
dell’espressione genica
Controllo trascrizionale:
esercitato da interruttori molecolari
fattori di trascrizione
proteine che si legano al DNA nel
sito promotore dei singoli geni o in
corrispondenza di altre sequenze
regolatrici (enhancers, silencers)
poste anche a 20kb dal gene
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Fattori di trascrizione:
meccanismo d’azione
Sequenza di riconoscimento specifica
Fattori di trascrizione che legano sequenze
distanti dal gene
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Regolazione coordinata dell’espressione genica
Un unico fattore di regolazione dell’espressione può controllare diversi
geni. Esempio: Recettore degli Androgeni, Recettore degli Estrogeni (ER)
Nucleo
RXRA Retinoic Acid Receptor a
OXT oxytocin
CRH Corticotropin-Releasing Hormone
ERE Estrogen Responsive Element 5’-GGTCAnnnTGACC-3’
Questa sequenza si trova nel promotore di tutti i geni controllati da ER
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Potenziali punti di controllo
dell’espressione genica
Splicing alternativo regolato da
proteine cellula-specifiche
Stabilità del mRNA
(l’emivita del messaggero incide
sulla quantità di proteina sintetizzata)
Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze
specifiche per la stabilità del messaggero
Inizio della traduzione
Può essere bloccata da proteine regolatrici
o fino all’aggiunta del 5’ CAP
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