Trascrizione - tandem | univr

Lezione 6
Trascrizione nei procarioti e
negli eucarioti
Regolazione dell’espressione
genica
1
Trascrizione
Processo mediante il quale
l’informazione contenuta in
una
sequenza
di
DNA
(gene) viene copiata in una
sequenza complementare di
RNA
dall’enzima
polimerasi
2
RNA
Solo una frazione del genoma viene trascritta, quella CODIFICANTE,
organizzata in unità funzionali dette GENI
Trend evolutivo: con l’aumentare delle dimensioni del genoma
aumenta la frazione non codificante
4300 geni
4,6X
<20000
geni
700X
dimensioni:
4,7
12,1
3
100
3300 Mb
Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi sequenze non codificanti
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non
codificanti
Gene 1
Gene 2
Gene 3
4
DNA non codificante 1
* < 2% del nostro genoma è rappresentato da sequenze esoniche
* Più del 98% del genoma umano è composto da sequenze non
codificanti proteine
* 26% del genoma umano è rappresentato da regioni introniche e
sequenze regolatrici dell’espressione genica
Sequenze regolatrici
5
DNA non codificante 2
* Una grossa percentuale del genoma umano è rappresentato da
retrotrasposoni (elementi in grado di copiarsi e poi di integrarsi
in altre posizioni del genoma) (8% sono sequenze di origine
retrovirale)
* Geni per RNA non codificanti proteine (rRNA, tRNA, RNA
coinvolti nella regolazione della trascrizione genica o nell’
inattivazione del cromosoma X)
* Pseudogeni (c.a. 20.000 sequenze simili a geni ma non più
funzionanti)
6
Pseudogeni
L’inattivazione non ha
effetti negativi perché
rimane
la
copia
originaria del gene
Il gene duplicato può
accumulare mutazioni che
fanno assumere nuove
funzioni: famiglie geniche
7
Trascrizione
gene
Filamento stampo
(coding strand)
Per ogni gene uno solo
dei due filamenti del
DNA è codificante
8
Geni diversi posti sullo stesso cromosoma
possono avere come “coding strand” filamenti
diversi del DNA
+
-
9
Visione d’insieme della trascrizione
10
Inizio della trascrizione
la RNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza del promotore
e “copia” il filamento di DNA stampo a partire dal sito di inizio
della trascrizione
11
Promotore
E’ una sequenza specifica del DNA che viene riconosciuta dalla RNA
polimerasi e determina DOVE la sintesi del mRNA inizia e QUALE
filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo.
Sito di inizio della
denaturazione
Promotore procariotico
12
Allungamento della catena dell’RNA
G
C
C G CU
GA
CC TC
I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può essere copiato. La RNA polimerasi,
a differenza della DNA polimerasi, non ha bisogno di un innesco
Procarioti: RNA polimerasi si lega direttamente al promotore
Eucarioti: fattori di trascrizione proteici legano il promotore prima dell’ RNA
13
polimerasi II
Allungamento della catena dell’RNA
3’
La RNA polimerasi ha attività elicasica
14
Allungamento della catena dell’RNA
A differenza delle DNA polimerasi, le RNA polimerasi non hanno
attività di “proof reading”
15
Effetto di errori delle polimerasi
DNA mutato
trascrizione
Errore
della DNA
polimerasi
Tutte le molecole di RNA
portano la mutazione
DNA wt
trascrizione
Errore
della RNA
polimerasi
16
Una sola molecole di RNA
porta la mutazione
Terminazione
Sequenze specifiche sul DNA (terminator) determinano l’arresto della
trascrizione in corrispondenza di un determinato nucleotide (STOP site)
17
Alfa amanitina inibisce le RNA pol eucariotiche
Polipeptide biciclico
L'avvelenamento con le amanitine è caratterizzato da un lungo periodo di latenza (dalle 6 alle
48 ore, in media 6-15 ore) durante il quale il paziente non accusa alcun sintomo. Le cellule,
rese incapaci di sintetizzare nuove proteine, interrompono bruscamente le proprie attività. Le
cellule del tratto intestinale e del fegato sono le più drasticamente colpite non appena vengono
in contatto con la sostanza e, nel caso di avvelenamento grave, l'unica possibilità di salvezza è
il trapianto di fegato.
Nei procarioti il trascritto viene subito tradotto in proteina …
19
…
nel nucleo delle cellule eucariotiche invece avviene un complicato
processo di MATURAZIONE prima che il trascritto venga esportato
nel citoplasma e tradotto.
20
Dal nucleo al citoplasma
pori nucleari
linfocita visto
al M.E. dopo
criofrattura
Dal nucleo dove avviene la trascrizione, gli RNA messaggeri maturi
passano attraverso i pori nucleari nel citoplasma, dove vengono
tradotti
21
Splicing
Nei geni degli eucarioti le
sequenze
codificanti
per
proteine (esoni) sono interrotte
da sequenze non codificanti
(introni).
Il trascritto primario, prima di
abbandonare il nucleo, viene
sottoposto ad un processo di
taglio e ricucitura (splicing):
gli introni vengono eliminati e
gli esoni riuniti uno all’altro.
La molecola di mRNA maturo
che esce dal nucleo sarà
costituita da una sequenza
codificante continua.
22
Splicing alternativo
23
Splicing alternativo
* Il fenomeno dello SPLICING alternativo negli eucarioti
aumenta il potenziale espressivo del genoma
* E’ la regola, non l’eccezione
* Mediante forme di splicing alternativo da uno stesso gene
possono derivare trascritti diversi che, una volta tradotti,
danno luogo a proteine simili ma diverse
24
Potenziale espressivo in H. sapiens
* In H. sapiens si stima che la percentuale di geni che
subiscono splicing alternativo sia >90% (Hallegger
M et al., 2010)
* N° geni H. sapiens : 20.000
* 18.000 geni subiscono AS
* Il numero medio di varianti di splicing prodotto da
ciascuno di questi geni è 4 (Kim H et al., 2004)
* La stima del numero di proteine prodotte da 20.000
geni è di 72.000
25
Splicing alternativo dell’ mRNA per la tropomiosina
(5 isoforme)
Tropomiosina: proteina che lega l’actina (coinvolta nella contrazione muscolare)
e fa parte delle proteine del citoscheletro nelle cellule non muscolari
26
Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…..
Nei procarioti più geni possono essere trascritti in un unico mRNA
mRNA policistronico
permeasi fa entrare
il lattosio nella cellula
enzimi che digeriscono il lattosio
Regolazione coordinata dell’espressione genica:
geni che codificano per proteine coinvolte nella stessa via metabolica (es
catabolismo del lattosio) vengono trascritti contemporaneamente poiché
sono sulla stessa molecola di mRNA
27
Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…..
Negli eucarioti sempre 1 mRNA = 1 gene
Stabilizzazione mRNA
Legame al ribosoma
Stabilizzazione mRNA
Esportazione mRNA dal
28
nucleo
Modificazioni post-trascrizionali del messaggero (5’CAP e
coda di poliA)
La quantità di un mRNA nella cellula dipende
dalla sua velocità di sintesi e di degradazione
L’emivita di un mRNA determina la quantità di proteina sintetizzata
29
mRNA eucariotico
Sequenza trascritta e maturata
Sequenza tradotta
UTR=UnTranslated Region
30
Regolazione dell’espressione genica
Solo alcuni geni vengono costituzionalmente trascritti per ogni cellula (geni
housekeeping: enzimi del metabolismo, RNA polimerasi, ribosomi, istoni…)
Per tutti gli altri esistono molti meccanismi che permettono di regolare se, quando
(meccanismi di regolazione temporali) e quanto un gene deve essere trascritto
Ciò è particolarmente evidente e importante negli organismi eucarioti
multicellulari dove esiste una regolazione tessuto specifica (cellule diverse producono
proteine diverse)
Anche nei procarioti tuttavia vi sono meccanismi di regolazione
dell’espressione genica OPERONI
31
Espressione tessuto-specifica
cardiomiocita
neurone
epatociti
Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti
Il pattern di geni espressi per ogni tipo cellulare è diverso
32
Potenziali punti di controllo
dell’espressione genica 1
Pre-trascrizionale
In primo luogo la conformazione
della cromatina condiziona la
trascrizione (cromatina addensata =
trascrizionalmente inattiva)
EUCARIOTI
33
Potenziali punti di controllo
dell’espressione genica 2
Controllo trascrizionale:
esercitato da interruttori molecolari,
fattori di trascrizione.
Proteine che si legano al DNA nel
sito promotore dei singoli geni o in
corrispondenza di altre sequenze
regolatrici (enhancers, silencers)
poste anche a 20kb dal gene
34
Fattori di trascrizione: meccanismo
d’azione
Sequenza di riconoscimento specifica
35
Regolazione coordinata dell’espressione genica
Un unico fattore di regolazione dell’espressione può controllare diversi geni.
Esempio: Recettore degli Estrogeni (ER)
Nucleo
gene 2
gene 3
gene 4
gene 1
ERE Estrogen Responsive Element 5’-GGTCAnnnTGACC-3’
Questa sequenza di riconoscimento specifica si trova nel promotore di tutti i geni
controllati da ER
Potenziali punti di controllo
dell’espressione genica 3
Splicing alternativo regolato da
proteine cellula-specifiche
Stabilità del mRNA
(l’emivita del messaggero incide
sulla quantità di proteina sintetizzata)
Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze
specifiche per la stabilità del messaggero
Inizio della traduzione:
Può essere bloccata da proteine
regolatrici o fino all’aggiunta
del 5’ CAP
38
Inibizione selettiva della traduzione di
mRNA
RNA materno legato a proteine che inibiscono la traduzione
Alcuni dei più notevoli casi di regolazione traduzionale dell’espressione genica
avvengono nell’oocita. L’oocita produce e accumula mRNA che spesso
verranno utilizzati solo dopo la fecondazione.
39