ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO Definizione CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita Principi di funzionamento • Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica) • Sistema ottico (laser Argon 488nm) • Sistema elettronico (software CellQuest) Sistema Fluidico Sistema Ottico Sistema Elettronico Parametri • LIGHT SCATTERING (Forward and Side Scatter) • FLUORESCENZA (FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC, ...) Light Scattering Sangue periferico Fluorescenza IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA Plot FITC/PE/Per CP Intensita’ F proporzionale ai siti di legame Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che: • identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo • ha una struttura biochimica definita • è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi Informazioni aggiornate www.courseware.vt.edu/users/kdelgert/ (www.bsi.vt.edu/immunology) www.ncbi.nlm.nih.gov/prow Applicazioni 1. determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari 2. valutazione del contenuto cellulare di DNA 3. discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche 4. predisposizione per la separazione cellulare Immunofenotipo Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti in caso di antigenti specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima Marcatori B-lineage TdT CD79a CD19 CD10 CD20 CD22 Cu SmIg Marcatori T-lineage CD7 CD2 CD5 CD3 CD1 CD4 CD8 TdT TCR Marcatori granulocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD117 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15 Marcatori monocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD14 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15 Marcatori eritrocitopoiesi CD34 CD45 CD33 CD71 CD105 CD36 GPA Gating CD 45 ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE Espressione CD45 Linfociti Monociti Granulociti maturi Cellule immature Eritrociti Granulociti immaturi Scelta degli antigeni e Criteri di Positività •ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B) •ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133) •Positività? Characteristic phenotype of B-precursor ALL with most common chromosomal aberrations MLL/AF4 t(4;11) CD45 Dim CD19 CD34 CD22 CD20 CD24 CD10 TDT cyIg CD15 CD65 CD13 Pos Pos Neg/dim Neg Neg Neg Pos Neg Often dim Often dim Mostly neg CD33 neg TEL/AML1 t(12;21) Dim Pos Pos Dim/pos Neg Pos Pos Pos Neg Neg Neg Often pos and/or (CD33) Often pos and/or (CD13) Neg Neg Neg Neg NV NV Hyperdiploidy Neg Pos Pos Pos Dim/pos Pos Bright Pos Neg Neg Neg Neg Neg BCR/ABL t(9;22) Neg/dim Pos Pos/neg Dim/pos Dim/pos Pos Bright Pos Neg Neg Neg pos and/or (CD33) and/or (CD13) Pos NV Neg NV Pos Dim E2A/PBX1 t(1;19) Dim Pos Neg Pos/dim Dim/pos Pos Neg/dim Pos Pos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg CD66c Pos NV Pos CD9 Pos Neg Neg NG2 NV NV NV CD135 NV NV NV CD25 NV NV NV CD38 Derived from ; Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias (Review) O.Hrusak and A.PorwitMacDonald Leukemia 2002 ALL-T ALL-T CD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT ,(CD34) ALL-B, common ALL-B, common CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15) ALL-B, B matura ALL-B, B matura CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT LAP LAP MPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR, CD41, CD56, CD61 (CD2) LAP G+15 dopo terapia con ATRA ESORDIO:popolazione blastica G+15:popolazione matura LAM Midollo osseo, liquido cefalorachidiano BM liquor Midollo osseo, sangue periferico, liquido cefalorachidiano BM PB liquor Neuroblastoma DATI RICERCA •Differenziamento Pession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene. 2003 Nov 27;22(54):8671-6. •Ciclo cellulare e apoptosi Pession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72. VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica : • multiparametricità • possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula • analisi di grandi quantità di cellule • riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni • grande sensibilità • rapidità di analisi • possibilità di ulteriori analisi a posteriori Conclusioni La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi emato-oncologica : • Identifica la malattia residua minima • Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione del midollo • Determina la presenza di malattia disseminata (ALL latente, santuari exramidollari)