Perché fare diagnosi di laboratorio ?
• formulazione di una diagnosi eziologica
non diagnosi di polmonite ma polmonite da adenovirus…
• adozione di una terapia mirata
• individuazione dei casi sentinella in
occasione di epidemie
• scopi epidemiologici
Diagnosi eziologica delle malattie
virali (approcci)
dimostrazione nel materiale patologico dell’agente
infettivo o suoi componenti
Diagnosi diretta
dimostrazione nell’organismo infettato di una
risposta anticorpale specifica
Diagnosi indiretta
diagnosi indiretta
Dimostrazione che è in atto una risposta immune
all’agente infettivo
in genere valutando la dinamica anticorpale mediante reazioni
sierologiche
presenza IgM indice di infezione recente
•rivelabili dopo 7-10 giorni dall’infezione
•breve permanenza (2-3 mesi)
Presenza solo IgG indice di infezione contratta in
passato
•rivelabili dopo 2-4 settimane dall’infezione
•permangono per anni
Diagnosi indiretta
1. dimostrazione di anticorpi specifici della classe
M (IgM) in un singolo campione di siero
2. dimostrazione di sieroconversione (negativo
positivo) o di incremento del titolo anticorpale
di almeno 4 volte in 2 campioni prelevati
• 1° - in fase acuta della malattia
• 2°- in fase convalescente (2-3 settimane più tardi)
Diagnosi indiretta - saggi
sierologici
•
•
•
•
•
agglutinazione
precipitazione
fissazione del complemento
neutralizzazione
inibizione dell’emagglutinazione (virus emagglutinanti)
• IF immunofluorescenza
• RIA radioimmunoassy
• test immunoenzimatici ELISA, immunoblot
Inibizione della emagglutinazione
diluizioni scalari del
siero in esame
+
quantità standard di
unità emagglutinanti
del virus (incubazione)
+
titolo degli Ab inibenti
emoagglutinantinazione la più
alta diluizione del siero capace
di prevenire emoagglutinazione
sospensione di globuli
rossi
Immunofluorescenza indiretta
cellule infettate da
virus
siero in esame
legame
Anticorpi anti IgG o
anti IgM umanefluoreseceinati
ELISA
Test indiretto per le IgG
Ag virale
siero in esame (oppure diluizioni scalari del siero)
anti IgG umane-Enzima
substrato viraggio colore
immunoblot
Diagnosi indiretta: punti critici
• riattivazione di virus latenti
• pazienti immunodepressi
• difficoltà di disporre di un siero
“acuto” o “convalescente”
Diagnostica virologica
metodi diretti
definizione
Dimostrazione del virus o suoi
componenti
Tipo di metodo
Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag virali
Ricerca del genoma virale
Diagnostica virologica
metodi diretti
definizione
Dimostrazione del virus o suoi
componenti
Tipo di metodo
Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag virali
Ricerca del genoma virale
Diagnostica virologica
metodi diretti
definizione
Dimostrazione del virus o suoi
componenti
Tipo di metodo
Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag virali
Ricerca del genoma virale
Isolamento in colture cellulari
allestimento delle colture in vitro
inoculazione del campione
incubazione
identificazione e tipizzazione del virus
Identificazione e tipizzazione dei
virus
effetto citopatico (CPE)
caratteristiche antigeniche
sequenze genomiche
•degenerazione cellulare
•cellule multinucleate o sincizi
•formazione di inclusioni
tipo di cellule sensibili
tempo di comparsa
velocità di progressione
dell’infezione
Inclusioni
Localizzazione
• nucleo (adenovirus, herpesvirus)
• citoplasma (virus della rabbia, poxvirus)
• entrambi (CMV, paramixovirus)
Tipo
• ammassi virioni (papovavirus)
• viroplasma (poxvirus)
• materiale cellulare proteico (adenovirus)
identificazione e tipizzazione dei
virus
effetto citopatico (CPE)
caratteristiche antigeniche
sequenze genomiche
reazioni sierologiche
identificazione e tipizzazione dei
virus
effetto citopatico (CPE)
caratteristiche antigeniche
sequenze genomiche
•ibridazione con sonde molecolari
•reazioni di amplificazione
Diagnostica virologica
metodi diretti
definizione
Dimostrazione del virus o suoi
componenti
Tipo di metodo
Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag virali
Ricerca del genoma virale
Diagnosi diretta - ricerca degli antigeni
•
•
•
•
•
agglutinazione
precipitazione
fissazione del complemento
neutralizzazione
emagglutinazione (virus emagglutinanti)
• IF immunofluorescenza
• RIA radioimmunoassy
• test immunoenzimatici: ELISA, immunoblot
Immunofluorescenza diretta
materiale patologico
Anticorpi virus
specifici -fluoreseceina
IDENTIFICAZIONE DI ANTIGENE DI CITOMEGALOVIRUS
SU LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI DEL LIQUOR
MEDIANTE IMMUNOFLUORESCENZA CON ANTICORPO
MONOCLONALE ANTI-pp65.
Diagnostica virologica
metodi diretti
definizione
Dimostrazione del virus o suoi
componenti
Tipo di metodo
Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag virali
Ricerca del genoma virale
Ricerca del genoma virale
Quali virus ?
difficilmente o non coltivabili
(HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19, HAV)
a lento sviluppo
(CMV, BKV, JCV)
pericolosi da coltivare
(HIV)
emergenti
(TTV)
Ricerca del genoma virale
Ibridazione
100 000 - 10 000 genomi
amplificazione ibridazione
10 - 1 genomi
Ibridazione con sonde
Tecniche quantitative
– Per distinguere infezione latente da infezione
attiva
– Per il monitoraggio dell’infezione
– Per il monitoraggio della terapia
– Per valutare il rischio di trasmissione
