Tipo di metodo
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Perché fare diagnosi di laboratorio ? • formulazione di una diagnosi eziologica non diagnosi di polmonite ma polmonite da adenovirus… • adozione di una terapia mirata • individuazione dei casi sentinella in occasione di epidemie • scopi epidemiologici Diagnosi eziologica delle malattie virali (approcci) dimostrazione nel materiale patologico dell’agente infettivo o suoi componenti Diagnosi diretta dimostrazione nell’organismo infettato di una risposta anticorpale specifica Diagnosi indiretta diagnosi indiretta Dimostrazione che è in atto una risposta immune all’agente infettivo in genere valutando la dinamica anticorpale mediante reazioni sierologiche presenza IgM indice di infezione recente •rivelabili dopo 7-10 giorni dall’infezione •breve permanenza (2-3 mesi) Presenza solo IgG indice di infezione contratta in passato •rivelabili dopo 2-4 settimane dall’infezione •permangono per anni Diagnosi indiretta 1. dimostrazione di anticorpi specifici della classe M (IgM) in un singolo campione di siero 2. dimostrazione di sieroconversione (negativo positivo) o di incremento del titolo anticorpale di almeno 4 volte in 2 campioni prelevati • 1° - in fase acuta della malattia • 2°- in fase convalescente (2-3 settimane più tardi) Diagnosi indiretta - saggi sierologici • • • • • agglutinazione precipitazione fissazione del complemento neutralizzazione inibizione dell’emagglutinazione (virus emagglutinanti) • IF immunofluorescenza • RIA radioimmunoassy • test immunoenzimatici ELISA, immunoblot Inibizione della emagglutinazione diluizioni scalari del siero in esame + quantità standard di unità emagglutinanti del virus (incubazione) + titolo degli Ab inibenti emoagglutinantinazione la più alta diluizione del siero capace di prevenire emoagglutinazione sospensione di globuli rossi Immunofluorescenza indiretta cellule infettate da virus siero in esame legame Anticorpi anti IgG o anti IgM umanefluoreseceinati ELISA Test indiretto per le IgG Ag virale siero in esame (oppure diluizioni scalari del siero) anti IgG umane-Enzima substrato viraggio colore immunoblot Diagnosi indiretta: punti critici • riattivazione di virus latenti • pazienti immunodepressi • difficoltà di disporre di un siero “acuto” o “convalescente” Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti Tipo di metodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti Tipo di metodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti Tipo di metodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Isolamento in colture cellulari allestimento delle colture in vitro inoculazione del campione incubazione identificazione e tipizzazione del virus Identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) caratteristiche antigeniche sequenze genomiche •degenerazione cellulare •cellule multinucleate o sincizi •formazione di inclusioni tipo di cellule sensibili tempo di comparsa velocità di progressione dell’infezione Inclusioni Localizzazione • nucleo (adenovirus, herpesvirus) • citoplasma (virus della rabbia, poxvirus) • entrambi (CMV, paramixovirus) Tipo • ammassi virioni (papovavirus) • viroplasma (poxvirus) • materiale cellulare proteico (adenovirus) identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) caratteristiche antigeniche sequenze genomiche reazioni sierologiche identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) caratteristiche antigeniche sequenze genomiche •ibridazione con sonde molecolari •reazioni di amplificazione Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti Tipo di metodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnosi diretta - ricerca degli antigeni • • • • • agglutinazione precipitazione fissazione del complemento neutralizzazione emagglutinazione (virus emagglutinanti) • IF immunofluorescenza • RIA radioimmunoassy • test immunoenzimatici: ELISA, immunoblot Immunofluorescenza diretta materiale patologico Anticorpi virus specifici -fluoreseceina IDENTIFICAZIONE DI ANTIGENE DI CITOMEGALOVIRUS SU LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI DEL LIQUOR MEDIANTE IMMUNOFLUORESCENZA CON ANTICORPO MONOCLONALE ANTI-pp65. Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti Tipo di metodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Ricerca del genoma virale Quali virus ? difficilmente o non coltivabili (HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19, HAV) a lento sviluppo (CMV, BKV, JCV) pericolosi da coltivare (HIV) emergenti (TTV) Ricerca del genoma virale Ibridazione 100 000 - 10 000 genomi amplificazione ibridazione 10 - 1 genomi Ibridazione con sonde Tecniche quantitative – Per distinguere infezione latente da infezione attiva – Per il monitoraggio dell’infezione – Per il monitoraggio della terapia – Per valutare il rischio di trasmissione
