ENRICO RODA M.D.
DISMICROBISMI INTESTINALI.
I PROBIOTICI
48° CORSO FERRATINI
28 maggio 2009
MICROBIOTA INTESTINALE UMANO
I MICRORGANISMI DELLA FLORA INTESTINALE SONO 10 VOLTE
MAGGIORI RISPETTO AL NUMERO TOTALE DI CELLULE
DELL’ORGANISMO UMANO
• 10
14 microorganisms
(1012 CFU/g)
• > 90% 2 DIVISIONI DOMINANTI (Bacteroides, Firmicutes); < 10% 5 DIVISIONI
SOTTODOMINANTI (Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Cyanobacteria
and Verrucomicrobia)
• > 58 FAMIGLIE: >>: Bacteroidaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae (C.l. I-XVIII); <<:
Bifidobacteriaceae, Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae
• >1000 specie
•∞ MICROBIOTA INTESTINALI
Come viene trasmesso il microbiota intestinale tra
gli esseri umani?
Membri dei Firmicutes e dei Bacteroidetes ritrovati nella
flora umana non crescono all’esterno
Trasmissione verticale dei microbi
Acquisizione del microbiota e dei geni relativi dai genitori come forma di eredità
genetica con possibilità di riprogrammazione
Effetto del genotipo dell’ospite e dei fattori ambientali sulla
composizione del microbiota
(studi gemelli adulti mono e dizigoti; studi su famiglie in aree
sviluppate e sottosviluppate)
SUPERORGANISMO
IL MICROBIOMA UMANO CONTIENE UN NUMERO DI GENI 100 VOLTE
SUPERIORE RISPETTO AI GENI DEL GENOMA UMANO
Arricchimento del contenuto genetico con sviluppi futuri
funzionali
L’Essere umano come superorganismo che è composto da
cellule e microrganismi che condividono a relazione simbiotica
mutualistica
ASSOCIAZIONE MUTUALISTICA
Relazione tra membri del microbiota e uomo descritta come commensale (un
partner trae beneficio mentre l’altro rimane inalterato)
Si preferisce usare il termine mutualistico in relazione alla popolazione
permanente della flora intestinal (la selezione di comunità stabili
favorisce relazioni di vantaggio)
Questa associazione mutualistica deriva da una lunga co-evoluzione:
ospite-microbiotao genoma umano-microbioma
OSPITE UMANO
MICRORGANISMO
• temperatura stabile
• anaerobiosi
• nutrienti
• protezione:
- effetto di barriera
- Modulazione sistema immunitario
- turnover dell’enterocita
• nutrizione:
-
SCFAs
vitamine
assorbimento ioni
detossificazione xenobiotici
PROGETTO INTERNAZIONALE MICROBIOTA UMANO
Goal:
IDENTIFICARE GENI UMANI IN RELAZIONE AL MICROBIOMA
Analisi di categorie funzionali di geni e pathways metabolici
attraverso approci omici (genomica, proteomica….)
Cambiamenti nella composizione della
flora intestinale e patologie del tratto
digestivo
Enteropatia
autoimmune
Malattia
diverticolare
Flora
intestinale
IBS
Cancro del
colon
NASH-obesità
IBD
SIBO
Intolleranza
alimentare
La Sindrome dell’intestino irritabile è una
patologia ad eziologia multifattoriale :
“vecchi” e “nuovi” fattori eziopatologici
Fattori psicosociali
Microbiota
Intolleranza
Infiammazione
Fattori genetici
Infezioni
Ipersensibilità
viscerale
Alterata motilità
Ipersensibilità alimentare
Acidi biliari
Neurotrasmettitori
Barbara et al., APT 2004
OUTLINE
Quali sono le evidenze che il microbiota è alterato nella
IBS?
Quali sono le conseguenze della alterata flora
intestinale?
– Attivazione del sistema immunitario mucosale intestinale
Interazione tra il microbiota e il sistema immunitario
mucosale
– Fattori genetici, alterata permeabilità, Toll Like Receptor
Possiamo intervenire sul microbiota nella IBS?
Colture fecali nella IBS
Balsari, 1982
Wyatt,
1988
Madden, 2001
Mättö,
2005
consistency
(n=20)
(n=2)
(n=12)
(n=26)
Lactobacilli
↓
↓
↓
↔
☺
Bifidobacter
ia
↓
↓
↓
↔
☺
Streptococc
i
-
↑
-
↔
☹
E. coli
-
↑
-
↔
☹
↔
↑
-
↔
☹
↓
-
-
↑
☹
Clostridium
Coliforms
Barbara et al. Am J Gastroenterol 2005
Tuttavia…
60-80% del microbiota
non può essere coltivato in vitro
Suau et al., Appl and Environ Microbiol, 1999
Profilo molecolare del microbiota
nelle feci di pazienti con IBS
( 16s rRNA sequencing)
Differenze significative tra librerie di cloni di
IBS e controlli
10 IBS-D, 8 IBS-C, 6 IBS-M pazienti
(Rome II)
23 controlli sani
Campioni fecali
profilo dell’acido nucleico Guanina Citosina
Preparazione del DNA batterico
Pool di DNA batterico in base al sottotipo di IBS
DNA frazionato in base alla % di GC
*
Selezione delle frazioni con divergenze
Clonaggio e sequenziamento dei geni 16s rRNA
*Permette il rilevamento di sequenze
anche per batteri non dominanti
Kassinen et al., Gastroenterology 2007;133:24-33
Riassunto dei dati relativi alle alterazioni del
microbiota nella Sindrome dell’Intestino
Irritabile
lactobacilli e bifidobacteria
enterobacteriaceae, coliforms e
bacteroides
IBS-D può avere un diverso
microbiota vs. IBS-C
Modico aumento nella conta dei
batteri nel piccolo intestino
•
Criteri di inclusione non chiari
•
Pazienti ospedalizzati
•
Terapie concomitanti
(antibiotici, probiotici, PPI)
•
Diverse diete
•
Diverso transito intestinale
•
H2BT non ideale per testare la
SIBO
Se questi cambiamenti sono casuali, consequenziali, o
piuttosto il risultato della costipazione o della diarrea non è chiaro.
Possibili conseguenze del microbiota
alterato
Aumentata produzione di gas
(King et al., Lancet 1998)
flora intestinale
Deconiugazione degli acidi biliari
GAS
Lume
B A
(Tannock et al., Appl Environ Microbiol
1989)
Cellule endoscrine
Cellule
Mucosa
immunitarie
Attivazione immunitaria (stimolazione
dei macrofagi)
(Ferrier et al., Am J Pathol 2006)
Aumentata permeabilità intestinale
ENS
(Moriez et al., Shock 2007)
Strato
muscolare
Muscolo liscio
Cambiamenti nella funzione di motore
intestinale
(Barbara et al., Am J Gastroenterol 2005)
Ipersensibilità viscerale
(Verdu et al., Gut 2006)
Confronto tra cellule del sistema immunitario
nella IBS e in altri disordini infiammatori
80
*#
70
*
60
*
#
#
*
P<0.001 vs HC
P<0.001 vs IBS
#
#
50
40
*
30
20
10
0
HC
IBS
UC
Colite
microscopica inattiva
UC
attiva
Cremon et al., Am J GE 2009
r = 0.75
p = 0.001
4
3
2
1
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
N° macrofagi < 5 mm to nerves
Frequency of abdominal pain
Severity of abdominal pain (VAS)
L’attivazione dei macrofagi attivati in prossimità dei nervi
colonici correla con il dolore addominale nella IBS
4
r = 0.70
p = 0.003
3
2
1
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
N° mast cells < 5 mm to nerves
Non evidenza di correlazione tra dolore addominale e numero di macrofagi
e rilascio di istamina e triptasi.
Barbara et al, Gastroenterology 2004
La riduzione di zonulin-1 nell’ IBS come spiegazione
dell’ aumentata permeabilità intestinale
Biopsie di colon di IBS o HC
Strato unico
di Caco-2
Permeabilità paracellulare
ZO-1 mRNA
*
100
10
1
0.1
0.01
0.001
HC
IBS
Dextran FITC UDO
delta ct ZO-1 (Log 10)
1000
*
2000
*
*
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
HC
C-IBS
D-IBS M-IBS
Piche T, Barbara G et al. Gut 2009
OUTLINE
Quali sono le evidenze che il microbiota è alterato nella
IBS?
Quali sono le conseguenze della alterata flora
intestinale?
– Attivazione del sistema immunitario mucosale intestinale
Interazione tra il microbiota e il sistema immunitario
mucosale
– Fattori genetici, alterata permeabilità, Toll Like Receptor
Possiamo intervenire sul microbiota nella IBS?
Bifidobacterium infantis migliora i sintomi della
IBS e riduce l’infiammazione
77 Rome II pazienti con IBS
• (64% donne)
• tutte le abitudini alimentari
Placebo
Bifidobacterium infantis
Lactobacillus salivarius
*
IL-10:IL-12 ratio
*P=0.05
6
4
* **
*
**
2
Post-Treatment
200
8
Composite Likert Score
Pre-Treatment
*
Treatment Period
0
150
*P=0.001
100
50
0
-2
1
4
8
12
B. infantis L. salivarius Placebo
Weeks
O’Mahony et al., Gastroenterology 2005
Effetti dei batteri probiotici sulle citochine
specie
citochine
riferimenti
Lactobacillus
plantarum
Casei
Bulgaricus
Reuteri
salivarius
IL-10
TNFa
TNFa
IL8
IFN g
Pathamakanthan S
Borruel N
Borruel N
Ma D
McCarthy J
TNFa IL10
TNFa IL12
IL10/IL12
Menard S McCarthy J
O’Mahony L
TNFa
Menard s
Bifidobacterium
breve
infantis
Streptococcus
termophilus
Effetti dei batteri probiotici sulla secrezione di
mucina
Caballero-Franco et al AmJ Physiol 92,G315, 2007
Bifido infantis e lactobacillus salivarius:
immunomodulazione della risposta agli agenti patogeni
Attenuazione della risposta proinfiammatoria delle cellule
intraepiteliali umane HT-29: NFkB e IL-8
Stimolazione della secrezione di IL10 e TNFa anti-infiammatorie da
parte delle cellule mieloidi dendritiche
O’Hara et al Immunology 2006;118:202
Effetti sulla motilità
VSL#3 riduce il transito colica nelle IBS
probiotici rilassano il colon prossimale in vitro
Lactobacilli acidophylus e Bifidobacterium bifidum stimolano
l’attività mioelettrica intestinale che si pensa elimini l’iperproliferazione batterica
Germ free
Lactobacilli acidophilus e
Bifidobacterium bifidum
Husebye et al Am J Physiol 2001;280:G368
Effetti biologici dei probiotici
Migliorano la funzione di barriera escludendo
competitivamente batteri patogeni, riducendo la
permeabilità aumentando la mucina (Lactobacilli)
Aumentano le citochine antiinfiammatorie
(Bifidobatteri)
Diminuiscono la motilità del colon senza alterare la
forma delle feci
Modulano il dolore intestinale
Competono nel colon con i batteri produttori di gas
Conclusioni
Evidenze iniziali suggeriscono che il microbiota è alterato
nei pazienti con IBS
Le conseguenze di questi cambiamenti portano ad
alterazioni con attivazione del sistema immunitario che
può contribuire a generazione i sintomi
Fattori genetici, difetti della barriera mucosale e dei TLRs
possono indurre risposte immunitarie disregolate nei
confronti del microbiota intestinale
Nuovi studi sono necessari per confermare questi dati
Malattia diverticolare
Manifestazioni cliniche
Sintomi
correlati al
gas
Flatulenza
Meteorismo
dolore addominale
Flora
intestinale
IBS
Diverticolosi
Razionale dell’uso di probiotici nel
trattamento della malattia diverticolare
I Probiotici esercitano funzione antibatterica
La stasi del contenuto luminale fornisce lo stimolo
per l’infiammazione intestinale
I probiotici possiedono effetti antinfiammatori a
livello delle superfici mucose
I probiotici alterano la composizione della flora
intestinale e influenzano la funzione intestinale
Rifaximina + Fibre
Glucomannano 2 gr/die ± Rifaximina 400 mg bid x 7 gg/mese
RCT (168 pazienti)
Proporzione di pazienti asintomatici o
lievemente sintomatici a 12 mesi
80
p=0.001
60
40
20
0
Rifax
Plac
Papi et al, AP&T 1995
Conclusioni - 1
Rifaximina: utile nel trattamento della MD
non complicata e nella prevenzione delle
complicanze
Mesalazina: utile (continua?) nel
trattamento della MD non complicata e
nella prevenzione delle complicanze (in
associazione?)
Associazione R+M: utilità ancora
indeterminata
Conclusioni - 2
Probiotici: a fronte di un solido razionale
fisiopatologico mancano attualmente
solide evidenze di efficacia
Chirurgia in elezione: non indicata,
nemmeno nel paziente giovane, al primo
episodio diverticolitico
Predisposizione
genetica
Dieta, patogeni,
farmaci…
Disregolazione SI
IBD
Stile di vita (fumo,
dieta, stress),
microbiota
Evidenze cliniche del ruolo della flora intestinale nella
patogenesi delle IBD
1. La malattia di Crohn e la rettocolite ulcerosa si localizzano
preferenzialmente nel colon e ileo (maggior concentrazione di
batteri)
2. Alterata composizione
3. La diversione del contenuto fecale previene e tratta la malattia di
Crohn e la pouchite: l’infiammazione compare dopo continuità
intestinale
4. Risposte sierologiche ad antigeni della flora intestinale
5. Risposte cellulari T ad antigeni microbiali nei pazienti con CD, UC
e pouchite
6. Antibiotici e probiotici migliorano istologicamente,
endoscopicamente e clinicamente le IBD
7.
Polimorfismi dei geni che codificano recettori batterici in CD
Balfour Sartor, Gastroenterology 2008
Pouchitis: risultato di un’alterata
flora ?
Aumentato numero di aerobi
Diminuita ratio anaerobi/aerobi
Diminuita concentrazione di bifido e lactobacilli
Aumentato pH fecale
Ruseler van Embden et al Gut 1994
Mantenimento della remissione
VSL#3 nel mantenimento della
pouchite cronica: risultati
Log rank test: p<0.0001
100
(%)
VSL#3
(85%)
80
60
40
20
Placebo
(6%)
0
0
2
4
6
8
10
12 (months）
Follow up post randomizzazione
Mimura T et al Gut 2004; 53: 108-14
Pouchitis
ECCO Statement: Terapia con probiotici
• VSL#3 (18 x 1011 di 8 ceppi batterici per 9 o 12 mesi) ha
dimostrato efficacia nel induzione della remissione[EL1b, RG
B]
• VSL#3 (9 x 1011) ha dimostrato efficacia nel prevenire la
pouchite [EL2b, RG C]
• Batteri intestinali diversi fra
soggetto obeso e normopeso
•Questi batteri sono coinvolti
nella
regolazione
del
peso
corporeo e
possono
essere
considerati fattori importanti
nell’epidemia dell’obesità
Bajzer, Nature 2006
• Il microbiota cecale
del topo obeso ha
importanza
significativa
• 50% riduzione nella
componente
Bacteroidetes, e
aumentata presenza
dei Firmicutes
Ley RE, PNAS 2007
• Una simile variazione nella
ratio Bacteroidetes / Firmicutes
è presente anche nell’essere
umano monitorizzato nel corso
di un anno di dieta ristretta per
carboidrati e grassi
• Aumento nella percentuale di
Bacteroidetes e riduzione nella
percentuale
di
Firmicutes
correla con la perdita di peso
Gordon, Nature 2006
