penetranza - vincenzonigro.it

Terapia genica
• Inibizione mirata dell’espressione genica per bloccare un
processo patologico
• Distruzione mirata geneticamente di specifiche cellule
• Supplementazione: fornire una copia funzionante del
gene difettoso
• Sostituzione: sostituire il gene mutante con una copia
funzionante in situ
Supplementazione: fornire una copia
funzionante del gene difettoso
• ex vivo: trasferire i geni clonati in cellule in coltura,
selezionare le cellule, espanderle in vitro e poi
immetterle nel paziente
• in vivo: trasferire direttamente i geni nel tessuto
bersaglio o in circolo, facendo in modo che poi arrivi al
tessuto bersaglio
ex vivo
Vettori non virali per la terapia genica
• Liposomi: vescicole sintetiche che si formano
quando alcuni lipidi sono in soluzione acquosa.
Possono essere anionici e circondano il DNA o
cationici e legano il DNA all’esterno
• iniezione diretta di plasmidi o bombardamento
del tessuto del DNA attaccato a pellets di
metallo (biolistico). Il trasferimento è molto
basso e il DNA non è integrato.
Liposomi
Virus per la terapia genica
• Retrovirus: sono ad RNA e sintetizzano cDNA che
integrano casualmente nel genoma dell’ospite quando si
dissolve la membrana nucleare (divisione cellulare)
• Adenovirus: sono a DNA e capaci di trasdurre ad alti titoli
tutte le cellule, ma in forma episomale. E’ molto forte la
reazione immunitaria. Morte di Jesse Gelsinger nel 1999
• Adeno-associati (AAV) hanno DNA a singola elica e si
potrebbero integrare sul cromosoma 19q13 grazie al
gene rep. Ma il 96% del genoma è deleto. Possono
ospitare fino a 4.5kb
• Lentivirus: sono retrovirus specializzati che infettano
anche le cellule non in divisione. Sono più complessi dei
retrovirus e sono capaci di un’espressione a lungo
termine.
Vettori virali per la terapia genica
Genoma
Stato
Capacità
Target
Dna
Integrato
Episomal
4.7 kb
D/ND
Adeno
Dna
Episomal
< 36 kb
D/ND
Retro
Rna
Integrato
8 kb
D
Lenti
Rna
Integrato
8 kb
D/ND
HSV
Dna
Episomal
>50kb
D/ND
AAV
Virus Adeno-associato
Famiglia: Parvoviride
Genere : Dependovirus
Genoma : DNAss 4.7kb
Bersaglio: Cellule in divisione e cellule non in divisione
Stato
: episomale/integrazione sito specifica su 19q13.3
Sierotipi : 10 AAV1-10
ITR
ITR
Cap
Rep
Rep78
Rep68
Rep52
Rep40
VP1
VP3
VP2
AAV2
AAV RICOMBINANTI
REP
ITR
p5
p19
TRANSGENE
CAP
p40
ITR
Plasmide Cis
TRANSGENE TERAPEUTICO MAX 4.5kb
ITR
ITR
Produzione di vettori rAAV
pro rep2
ITR2
Pro
ITR2
Transgene
cap
Trans
pA
E2A
Cis
E4
VAI
Adeno Helper
Tripla trasfezione
HEK 293 cells
(E1)
rAAV
rAAV Pseudotipizzati
ITR 2
ITR 2
gene terapeutico
AAV2/1 (6)
ITR 2
AAV2/8
Cap 3
Rep 2
Cap 4
Rep 2
Cap 5
Rep 2
Cap 7
Rep 2
Cap 8
ITR 2
AAV2/7
ITR 2
Rep 2
ITR 2
AAV2/5
ITR 2
Cap 2
ITR 2
AAV2/4
ITR 2
Rep 2
ITR 2
AAV2/3
ITR 2
Cap 1
ITR 2
AAV2/2
ITR 2
Rep 2
ITR 2
DIFFERENZE TRA SIEROTIPI AAV 1-8
PROTEINE CAPSIDE
 ANTIGENICITA’

TROPISMO

AAV1 Muscolo,retina

AAV2 Muscolo,fegato

AAV4 Cervello

AAV5 Cervello,polm.

AAV6 Muscolo,retina

AAV7 Muscolo,fegato

AAV8 Fegato

RECETTORI

AAV2 FGFR1,EPARINA

AAV4

Ac.SIALICO

AAV5
PDGFR,
Ac.SIALICO
Vantaggi
•Non patogeni
•Espressione genica efficiente e a lungo termine
•Pochi effetti immunologici
•Ampia varietà di cellule ospiti
•Infezione di cellule in divisione e non in divisione
Svantaggi
•Dimensioni dell’inserto non superiori alle 4.5kb
•Produzione di anticorpi anti-AAV
AAV2
No risomministrazione del vettore virale
Analisi di linkage
Vincenzo Nigro
Dipartimento di Patologia Generale
Seconda Università degli Studi di Napoli
Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
trasmissione autosomica dominante
un genitore
Aa
Aa
Aa
entrambi i genitori
aa
aa
Aa
aa
AA
Aa
A
allele patologico dominante
a
allele normale recessivo
aa
75% dei figli
manifestano il
carattere senza
preferenza di sesso
50% dei figli
manifestano il
carattere senza
preferenza di sesso
A
a
Aa
Aa
a
a
A
a
A
a
Genotipi: 1/2 Aa, 1/2 aa
Genotipi: 1/4 AA, 1/2 Aa, 1/4 aa
Fenotipi: 1/2 affetti, 1/2 non affetti
Fenotipi: 3/4 affetti, 1/4 non affetti
Espressività
•Espressività: grado con il quale la malattia è espressa in un individuo
•al livello di popolazione un fenotipo presenta espressivita’ variabile quando
all’interno dell’insieme di soggetti sicuramente portatori il fenotipo presenta
gravita’ e/o complessita’ diversa
•anche all’interno della famiglia ci puo’ essere espressivita’ variabile
•importanza di un accurato esame clinico esteso ai consanguinei di un affetto,
anche apparentemente sani
•Il tipo e la gravità delle manifestazioni cliniche non sono sempre sovrapponibili
negli individui affetti dalla stessa patologia autosomica dominante
mutazioni eterozigoti di PAX3
Waardenburg
• sordità (o deficit uditivo di vario livello) bilaterale,
• modifiche nella pigmentazione, sia dei capelli (albinismo
parziale, in genere piebaldismo) che della pelle,
• anomalie nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta
neurale
• lateralizzazione del canto mediale
• diverso colore degli occhi (eterocromia), di solito uno
marrone e l'altro blu
Espressivita’ variabile

SINDROME DI WAARDENBURG
 Sindrome completa: sordita’ + occhi di colore diverso + ciuffo di
capelli bianchi sulla fronte + precoce incanutimento
1 sordità
2 sordità+ occhi di colore diverso
3 sordità+ occhi di colore diverso + ciuffo di capelli bianchi sulla fronte
4 ciuffo di capelli bianchi sulla fronte + precoce incanutimento
esordio variabile
• il fenotipo puo’ comparire in età avanzata
• il fenotipo non è congenito pur essendo ereditario
• dal punto di vista genetico raramente questi fenotipi sono
dovuti a nuove mutazioni
• a livello di popolazione l’allele mutato puo’ essere
frequente, purché l’ insorgenza si verifichi dopo l’inizio
dell’età riproduttiva e non limiti la fitness (capacita’ di
riprodursi)
penetranza
proporzione di individui portatori del gene patologico che
hanno segni clinici della malattia
può dipendere:
–
accuratezza diagnostica (esami clinici e di
laboratorio mirati - es. porfiria acuta)
–
età (esordio variabile - es. Corea di Huntington)
–
meccanismo d’azione del gene (retinoblastoma,
teoria dei 2 hits di Knudson)
tratti autosomici dominanti
penetranza
Penetranza 100 %
Penetranza 50 %
penetranza
la penetranza è un concetto che si riferisce alla popolazione
A livello del singolo individuo il carattere ha solo due possibilità
1.
2.
si manifesta
non si manifesta
è presa in considerazione più frequentemente nei caratteri dominanti
Sapere che un gene puo’ non essere completamente penetrante, e’
critico per studiarne la genetica o fornire consulenza genetica: un
certo soggetto che non manifesta il carattere puo’ essere portatore
del gene.
Età di insorgenza della Corea di Huntington
a)
Probabilità che un individuo portatore del gene mutato abbia sviluppato i
sintomi ad una data età
b)
Rischio che il figlio sano di un soggetto affetto sia portatore del gene
mutato ad una determinata età.
Penetranza ed espressivita’
La penetranza ridotta non e’ da confondere con l’espressivita’
variabile
L’espressivita’ e’ il grado di gravita’con cui fra gli individui che
presentano il fenotipo questo si esprime: puo’ costituire un
sottoinsieme degli individui “penetranti”
Es. Neurofibromatosi: presenza di tumori lungo i nervi periferici e
regioni di pigmentazione scura (“macchie di caffelatte”)Tutti i
portatori presentano almeno uno dei segni, ma la gravita’ puo’
essere diversa anche all’interno della stessa famiglia: un genitore
con macchie e piccoli tumori cutanei benigni puo’ avere un figlio
che presenta tumori estesi e maligni. (questa differenza non e’
prevedibile si puo’ solo quantizzare il rischio di ereditare l’allele
non il fenotipo)
ipotesi sul rischio di ricorrenza
1.
La malattia non è genetica
2.
La malattia è dovuta a nuova mutazione dominante: rischi di ricorrenza
trascurabili nella prole della coppia
3.
La trasmissione è autosomica recessiva: rischio di ricorrenza di 1 su 4 per
la futura prole indipendentemente dal sesso
4.
La malattia è legata all’X recessiva e la madre può essere o meno
portatrice: rischio di ricorrenza di 1 su 2 maschi se la madre è portatrice
5.
La malattia è poligenica o cromosomica: rischio di ricorrenza ben definito
dipendente dal tipo di malattia
mappaggio genico
serve ad identificare la posizione cromosomica di un locus genico
possono essere “mappati”:
– marcatori genetici anonimi, quali brevi sequenze di DNA (dette
STS), DNA microsatelliti, ecc.
– geni
– loci associati a malattie con trasmissione mendeliana
– loci associati a predisposizione a malattie con trasmissione
nonmendeliana
a cosa serve il mappaggio in genetica medica?
– per identificare la localizzazione dei geni malattia
– per fare diagnosi indiretta in una famiglia in cui la mutazione
responsabile di una malattia genetica mendeliana non è
stata ancora identificata
– per identificare i geni responsabili della suscettibilità a
malattie non mendeliane
per localizzare e identificare geni malattia
Linkage mapping
per fare diagnosi indiretta in una famiglia in cui la
mutazione responsabile di una malattia genetica
mendeliana non è stata ancora identificata
per identificare i
geni associati
ad una
suscettibilità a
malattie non
mendeliane
Segregazione e crossing-over
un figlio riceve un
cromosoma da ciascun
genitore che è il prodotto
finale della ricombinazione
meiotica
Non è possibile ricevere un
cromosoma che non abbia
effettuato crossing-over
principi generali del mappaggio
• si segue la segregazione della
patologia nei pedigrees
utilizzando marcatori genetici
a posizione nota
• si correla la segregazione
della patologia e dei marcatori
in più famiglie
• quanto più spesso la patologia
e un marcatore co-segregano
tanto più sono vicini
*
*
*
*
*
*
c’è bisogno di famiglie abbastanza grandi in cui si
osserva la trasmissione della patologia
i membri della famiglia devono essere
genotipizzati usando marcatori polimorfici
marcatori polimorfici sono noti per ogni
cromosoma e di ciascuno si conosce
esattamente la posizione cromosomica
i marcatori più informativi sono quelli che
presentano un elevato grado di eterozigosità,
perché questo consente di distinguere l’allele
paterno dall’allele materno
La nomenclatura D20S906 indica che un
marcatore di DNA è singolo nel genoma ed è
localizzato sul cromosoma 20; purtroppo il
numero 906 non ha alcun rapporto con la
posizione
Marcatori polimorfici
A partire dagli anni ‘80
RFLP: restriction fragment length polymorphisms
Nella accezione attuale, il DNA purificato è amplificato con la PCR.
Il prodotto della PCR è quindi tagliato in frammenti di restrizione mediante
enzimi di restrizione detti endonucleasi, che attuano il taglio unicamente in
corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche, specifiche per ogni
enzima.
I frammenti di restrizione sono separati per lunghezza mediante elettroforesi
su gel d'agarosio
RFLP
l’enzima di restrizione SmaI taglia l’esanucleotide CCCGGG. La
sequenza CCGGGG rende non digeribile il DNA in quella posizione

CCGGGG
GGCCCC
CCCGGG
GGGCCC
a
c
Allele 1
c
b
a
b
Allele 2
STR
• A partire dal 1990
STR: short-tandem repeats or microsatellites
–e.g. (CAn)
– gttatcttagggctcagtcacacacacacacacacacacatccaggtattggatcaac
Quello che varia tra gli alleli è il numero di ripetizioni dell’elemento. E’
molto più frequente riscontrare individui eterozigoti, con un numero di
ripetizioni differente nei due alleli
Figura 12, microsatelliti
Tandem repeat
Allele 1
Allele 2
Allele 3
Allele 4
(1,4)
(1,3)
(1,2)
(2,3)
SNPs
single nucleotide polymorphisms
• Variazioni puntiformi della sequenza
tra due copie del genoma
• Per un SNP un individuo può essere
– Omozigote T/T o C/C
– Eterozigote T/C
ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA
GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTC
CGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC
GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC
AGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCT
CTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGAACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGAC
GTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGC
GCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGG
CTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCC
TGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGAC
CTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCAC
ACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTC
GAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCT
CGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGA
GACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATAT
AGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCG
AGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTC
GAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGA
CGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAG
CGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAG
ACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCG
CTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTC
GAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGAC
CTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATA
GCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACA
CGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCG
AGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGC
ACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCT
CGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCT
GAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACAC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC
AGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCT
CTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA
Variazioni della sequenza del DNA
SNPs nel genoma umano
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
DB SNP built 128 (23 Oct 2007)
Totale
Totale codificanti
Codificanti sinonimi
Codificanti nonsinonimi
11.751.216
111.003
46.621
64.382
Aploblocchi sul sito http://www.hapmap.org
22 + 1
DNA recombination
22 + 1
A-
(♂)
A-
2 (22 + 1)
2 (22 + 1)
B-
♁
Meiosis
♂
A-
B-
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
(♂)
♁
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
chr1
-A A-
-B B-
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
-A
-B
chr1
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
-A
B-
-B
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
(♁)
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
NR
chr1
chr1
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
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G
-A
R
-B
chr1
A-
chr1 chr1
(♁)
A-
Diploid gamete
precursor cell
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
B-
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
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A
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G
-A
-B
chr1
Haploid gamete
precursors
B-
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
R
chr1
C
A
A
T
G
C
T
T
T
A
A
G
C
G
A
T
G
T
A
C
-
G
T
T
A
C
G
A
A
A
T
T
C
G
C
T
A
C
A
T
G
-A
NR
-B
chr1
Hap. gametes
ricombinanti R e non ricombinanti NR
il 50% deve essere R e il 50% NR se i loci sono posti
su cromosomi differenti, mentre i NR sono >50% se i
loci sono sintenici.
L’analisi della frazione di
ricombinazione è alla base del
mappaggio
• la frazione di ricombinazione tra due loci, q, è
compresa tra 0 e 0.5
• Il valore di q non può mai essere maggiore di 0.5, il
che indica che i loci sono posizionati molto lontani o
su cromosomi differenti
• se q è significativamente minore di 0.5 i loci sono
“linked”
• più piccolo è q più vicini sono i loci
l’unità di misura della distanza genetica è
il centiMorgan cM
La distanza genetica tra due loci è il
numero atteso di crossovers per meiosi
l
l
l
l
le distanze piccole sono accurate mentre le grandi
sono sottostimate perché un doppio crossover può
far pensare a un non ricombinante
per valutare distanze grandi occorre sommare
distanze piccole
per q <10% la correlazione tra q e cM è 1:1
mediamente 1 cM corrisponde a circa 850.000 bp,
ma tale valore è inversamente proporzionale alla
frequenza di ricombinazione
Le meiosi si visualizzano con MLH1
che è parte del macchinario di
ricombinazione
Nella meiosi maschile che avviene
nei testicoli ci sono circa 51 chiasmi
e quindi considerando 50cM per
chiasma, il genoma è di 2550 cM
Nella meiosi femminile che è più
difficile da studiare perché avviene
a 16-24 settimane di vita fetale ci
sono almeno 70 chiasmi (3500 cM),
ma si stimano 4280cM
Dal momento che la frequenza di
ricombinazione è differente si usa
un valore medio tra i due sessi
Il mappaggio per linkage è basato sull’analisi
della ricombinazione
= affetto
= non affetto
Locus malattia
Marker
dd
25
Dd
11
Dd
12
Dd
13
Dd
13
dd
34
dd Dd
dd
Dd
24
14
24
23
D = allele patologico
d = allele wild-type
1° obiettivo - stabilire la fase
dd
25
Dd
12
Doppio eterozigote
Dd
13
Dd
11
Dd
13
dd
34
dd Dd
dd
Dd
24
14
24
23
2° obiettivo – contare i ricombinanti
dd
25
Dd
11
Dd
12
Dd
13
Dd
13
NR
NR
dd
34
dd Dd
dd
Dd
24
14
24
23
NR
NR
NR
R
recombinanti
q = 1/5
lod-score
• Il lod-score misura le probabilità a favore
del linkage
• Compara la probabilità ad un certo valore
di q e la probabilità nel caso non vi sia
alcun linkage e quindi che q sia uguale a
0.5
LOD = log of the odds
[L(q)/L(0.5)]
Z(q) = log10
3° obiettivo – calcolare il LOD score
dd
25
Dd
11
Dd
12
Dd
13
NR
dd
34
Dd
dd Dd
dd
Dd
13
24
14
24
23
NR
NR
NR
NR
R
LOD SCORE (LOD)
Z = log10
q R ( 1- q) NR
0.5 (R+NR)
= log10
q ( 1- q) 5
0.5 6
Il metodo
• La probabilità L(q) è calcolata per i differenti valori di
q tra 0 e 0.5
• Un rapporto tra le probabilità è calcolato LR(q) =
L(q)/L(0.50)
• Il lod-score è il logaritmo in base 10 (log10) del
rapporto tra le probabilità
Z(q) = log10[L(q)/L(0.50)]
• La migliore stima della frazione di ricombinazione è il
valore di q a cui Z(q) è massimo (MLS)
Per le patologie a trasmissione mendeliana
Z(q) >> 3  si accetta il linkage per un
carattere autosomico
Z(q) >>2  si accetta il linkage per un
carattere X-linked
Z(q) < -2  si respinge definitivamente l’ipotesi
di linkage per un particolare valore di q
Z(q) > -2 ma < 3  occorrono ulteriori studi
linked, no
recombination
Link utile
http://linkage.rockefeller.edu