Uptake, biotransformation, elimination and accumulation of

Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro
Facoltà Scienze M.F.N.
ECOLOGIA II
Francesco Dondero, PhD
LEZIONE IV
Metalli Pesanti: Meccanismi di
Tossicità e Detossificazione nella
Cellula Eucariota
Destino di un composto chimico in un sistema biologico
Esposizione ambientale
Uptake
trasporto
bioaccumulo
metabolismo
Reazione con bersaglio
(neutralizzazione)
(effetto tossico)
trasporto
escrezione
Biotrasformazione
• Può determinare il destino di un
inquinante in un organismo
• Funzioni/effetti
– Facilita l’eliminazione
– Converte la sostanza in una forma meno
tossica (detossificazione)
– Converte la sostanza in una forma più tossica
(attivazione)
Meccanismi generali di
biotrasformazione
Metalli o Metalloidi
Composti organici xenobiotici
Fase I
Bio-methylation
Biomineralizzazione
Legame con
metallotioneine
o altre molecole
a funzione
sequestrante
Eliminazione o sequestramento
Fase I di
biotrasformazione
Fase II
Biotrasformazione
Eliminazione
Metalli pesanti
Metalli pesanti (2)
• Elevata affinità chimica per S > N > O, elementi
cioè nucleofili che hanno a disposizione una
coppia di elettroni.
• Possibilità di formare legami di coordinazione
mettendo a disposizione orbitali complessi di
tipo d, e , f
• Per questo motivo vengono definiti composti
elettrofili
Orbitali d / f disponibili
Funzioni biologiche dei metalli
pesanti
Le funzioni biologiche dei metalli pesanti
sono dovute alla loro natura chimica.
• Coordinazione strutturale. Atomi di metallo pesante
possono stabilire interazioni chimiche attraverso legami
di coordinazione con gruppi nucleofili di proteine, in
particolare il gruppo R sostituito –SH dell’aminoacido
CISTEINA, o l’anello imidazolico dell’ISTIDINA dove è
presente un atomo di N con a disposizione un doppietto
elettronico. Caso dello Zinco (Zn2+).
• Possono esistere con stati di ossidazione differenti e
permettere il trasporto degli elettroni. Caso del Rame
(Cu I/II)
Basi Biochimiche della Coordinazione strutturale
Doppietto elettronico
disponibile per la
coordinazione da parte del
metallo pesante (Zn)
Coordinazione strutturale
Enzima Carbonico Anidrasi
Coordinazione strutturale
L’atomo di zinco è
coordinato da 3 atomi
di N appartenenti al
gruppo imidazolico
dell’istidina.
Si parla di
Coordinazione
Struturale quando il
metallo pesante è
presente per
permettere la
creazione di un
ripiegamento specifico
della proteina.
Lo Zn non partecipa
per se alla catalisi
enzimatica
Enzima Carbonico anidrasi: dettaglio del sito catalitico
Metalli pesanti nel trasporto degli
elettroni
• Citocromi mitocondriali aa3. Partecipano
al trasporto degli elettroni con modalità
simili a quelle previste per il Ferro nel
citocromo p450.
• Hanno una funzione chiave nella catalisi
enzimatica.
I° Corollario
I metalli pesanti:
– Elevata affinità chimica per S > N > O
– Scala di affinità dei metalli per S, N, O: Hg+
+
>Ag+>Cu+>Cd++>Cu++>Zn++
Tossicità dei metalli pesanti
• 1) Sostituzione specifica in un sito attivo di un
enzima per maggiore affinità chimica
(inattivazione).
• 2) Interazione aspecifica con gruppi nucleofili
(S,N,O) di proteine o altre macromolecole
cellulari. Reattività.
• 3)Solo nel caso del Rame. Generazioni di
radicali liberi dell’ossigeno (ione O2-)
mediante redox cycling (vedi schema cyt
P450) e reazione di Fenton con perossidi
(organici).
Tossicità dei metalli pesanti
• 1) 3)Solo nel caso del Rame. Generazioni di
radicali liberi dell’ossigeno (ione O2-)
mediante redox cycling (vedi schema cyt
P450) e reazione di Fenton con perossidi
(organici).
Reazione di Fenton
Cu+ + H2O2 → Cu2+ + OH° + OH−
Base comune della tossicità dei
metalli pesanti
• DEREGOLAZIONE DELL’OMEOSTASI
DEL CALCIO attraverso interazione con
gruppi sulfidrilici di proteine
• L’importanza del calcio (Ca++) come
secondo messaggero nei processi di
trasduzione del segnale intracellulare è
fondamentale.
Modalità di uptake dei metalli
pesanti ed effetti sui trasportatori
ionici
1. Complessazione: ionofori:
Uptake di Me
molecole anfipatiche che
complessano il me e
permeano la membrana per le
loro caratteristiche idrofobiche
2. Traporto passivo (canali)
3. Trasporto attivo (pompe
ATPasi)
Effetto sui sistemi di trasporto attivo (ATPase) e 4. Endocitosi
passivo (canali)
In ogni caso, gli effetti dei metalli pesanti sono riconducibili ad una interazione
(legame) tra residuo di cisteina in un sito catalitico (ATPasi) o in un sito critico
del trasportatore (canali ionici)
Effetto sul reticolo endoplasmatico
• Il reticolo sarcoplasmatico e i calciosomi rappresentano
gli organelli subcellulari deputati alla riserva del calcio
intracellulare, rispettivamente in cellule muscolari e non
muscolari.
REL/calciosoma
Stesse modalità di effetto della membrana plasmatica, ma a livello del rel. Da
notare che effetti negativi sul rel si possono ripercuotere anche a livello di
metabolismo di fase I o II (organici xenobiotici)
Effetto sul mitocondrio
• Il mitocondrio assume un ruolo particolare nell’omeostasi del calcio
quando questo raggiunge concentrazioni intracellulari al limite del
patologico. I metalli pesanti possono inibire l’uptake del Ca
all’interno del mitocondrio.
• Inoltre i metalli pesanti possono determinare una diminuzione del
rapporto NADH/NAD e un calo del potenziale della membrana
interna che esemplifica l’efficienza delle attività mitocondriali legate
al trasporto degli elettroni e la respirazione ossidativa
mitocondrio
Effetto sulla [Ca++]i / trasduzione del segnale
Il calcio è un importante 2° messaggero dei processi di trasduzione
cellulare.
Esempio di tossicità del metallo pesante mediata dal Calcio (Calcium
Mediated Cytotoxicity)
Una bassa concentrazione di mercurio determina un aumento del [Ca++]i
sostenuto nel tempo (traccia a in riquadro A).
L’ormone bradikinina trasmette la sua informazione attraverso un
transiente di calcio, cioè una rapida modulazione della [Ca++]i (traccia a
in riquadro B).
L’effetto della bradikinina in presenza di Hg risulterebbe alterato e male
interpretato dalla cellula.
Interazione aspecifica con N, O
– Reazione con gruppi N, basi azotate del DNA
-mutazioni, rotture DNA, rotture cromosomiche, effetto
sull’espressione dei geni, apoptosi
Reazione con gruppi OH, zuccheri, proteine, etc.
Inattivazione di macromolecole biologiche
Omeostasi dei metalli pesanti
• 1) Complessazione con Glutatione
• 2) Complessazione con Metallotioneine
• 3) Accumulo nel sistema vacuolarelisosomiale / esocitosi
• 4) Formazione di precipitati insolubili
(granuli inorganici)
Glutatione
•Prima difesa contro I metalli pesanti e lo stress ossidativo
•Tripeptide
•2 mM circa nella cellula!
Ruolo del GSH
• Riduzione di ponti disulfuro sulle proteine
• Riduzione dei perossidi cellulari ed esogeni
Metabolismo del Glutatione
DDB0186120---Glutamatecysteine ligase (GCS heavy
chain)
DDB0184051 Eukaryotic
glutathione synthase
DDB01689521
Glutathione reductase.
DDB0167363 glutaredoxin-
like
DDB0168449 thioredoxinlike
DDB0187374 ;DDB0186269
DDB0167587; DDB0217453
DDB0168563; DDB0206511
DDB0168319; DDB0187641
DDB0204466; DDB0191799 tetha
GSH / metalli pesanti
• La presenza di un gruppo tiolico –SH fa da esca per il
metallo pesante
• I metalli pesanti si attaccano al glutatione attraverso un
meccanismo non enzimatico, a differenza delle molecole
organiche provenienti dal fase I, che richiedono
l’intervento delle GLUTATIONE TRASFERASI
Complessazione di Hg++ con
GSH
•
2 GSH + Hg2+ > GS-Hg-SG
Stress ossidativo ad opera di
metalli pesanti diversi dal Rame
• Il consumo di glutatione ad opera dei metalli
pesanti se non è seguito da un rapido ripristino
delle riserve porta rapidamente a fenomeni di
stress ossidativo (lipoperossidazione lipidica).
• Per questo motivo, metalli che non possono
andare in contro a redox cycling (Cu), come
Cadmio e Mercurio, sono comunque in grado di
scatenare stress ossidativo nella cellula.
Metallotioneine
Proteine:
•Ubiquitarie,
•Citosoliche,
•Mr (6-8 Kda)
•30% cisteina (-SH)
•Alta affinità per
Hg>Cu+>Cd>Cu++>Zn
•No strutture secondarie
Spesso esistono come come famiglia multigenica, come per cytP450. Cio’ denota
una certa importanza dal punto di vista evoluzionistico.
Coordinazioni Me-proteina
Formazione di legami tetratiolati Metalli – gruppi –SH della Metallotioneina
Coordinazioni Me-proteina
Formazione di legami tetratiolati Metalli – gruppi –SH della Metallotioneina
Meccanismo di azione della
metallotioneina
• 1) Ruolo fondamentale di un pool
fisiologico
di
zinco-metallotioneine
preesistenti, che in presenza di altri metalli
più affini (Hg, Cu e Cd), rilasciano zinco
per legare gli ioni più tossici
Inducibilità di MT
2) I metalli pesanti accumulati in
eccesso nella cellula possono stimolare
la neo-sintesi di metallotioneina
Inducibilità genica
Schema di un promotore genico di metallotioneina. I box riportati
rappresentano elementi genetici di regolazione in cis, su cui si possono
legare fattori di trascrizione che promuoveranno la trascrizione del gene.
Il fattore di trascrizione meglio descritto è Metal Transcription Factor 1
(MTF1), il quale si lega alle sequenze MRE.
A sottolineare il filo che lega i metalli allo stress ossidativo, MTF1 è attivo in
presenza di metalli pesanti e di ossidanti, quali l’acqua ossigenata o
perossidi organici
Basi molecolari per l’attivazione dei geni di metallotioneina
Destino della metallotioneina in
cellule di mollusco
Geni in Mytilus:
MT20 & MT10
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10
20
30
40
50
60
70
80
90
MT20_1a
ATGCCTGGAC CTTGTAACTG CATTGAAACA AACGTGTGTA TTTGTGGTAC CGGATGCAGC GGGAAATGTT GTCAATGTGG AGACGCCTGT
MT10_2
ATGCCTGCAC CTTGTAACTG TATCGAATCA AATGTGTGTA TCTGTGGCAC TGGGTGTAGC GGTGAAGGTT GTCGCTGTGG TGACGCCTGC
Clustal
******* ** **********
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** ** *** **
** *** ***
*****
********
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100
MT20_1a
110
120
130
140
150
160
170
180
AAATGTGCAA GTG---GCTG CGGATGTTCT GGGTGTAAAG TTGTTTGCAG ATGTTCAGGT ACCTGTGCGT GTGGATGTGA CTGCACTGGT
MT10_2
AAGTGCTCGG GCGCCGACTG TAAATGTTCC GGTTGTAAAG TAGTTTGCAA GTGTTCAGGT AGCTGTGCGT GTGAAGCAGG GTGTACAGGA
Clustal
** **
*
* *
***
******
** ******* * *******
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190
200
210
MT20_1a
CCGATAAACT GCAAATGTGA ATCTGGATGC TCCTGCAAG
MT10_2
CCTTCAACGT GTAGATGTGC ACCTGGTTGC TCCTGCAAA
Clustal
**
**
* * * *****
* **** *** ********
********* * ******** *** *
*
** ** **
MT10 vs MT20: espressione basale
Q-PCR amplification plot
Target gene
Ct
CV
E
cDNA copies · ng RNA-1
MT10 III
MT20 IV
MT10 molecules
MT20 molecules
~ 104
P<0.01 n=8
MT10
17.25
1.5
91%
1.05 105
MT20
29.65
5
92%
12.3
Actin
17.15
1.5
92%
N.D.
MT10 vs MT20: effetto dei metalli
Q-PCR amplification plot: MT20
IV
Q-PCR amplification plot: MT10
rRNA
bulk
rRNA
bulk
Cd
Cd
control
control
Cu
Cd has high effect: ~ 2000 fold up
Cu has negligible effect
Cu
Cd and Cu has similar effects
III
Effetto del radicale idrossile
Cu + H2O2 genera OH°
OH° induce il gene MT20 IV