Principio del metodo Le cellule necessarie per il conteggio vengono colorate/stabilizzate, quelle non desiderate vengono distrutte. Il prelievo di sangue venoso anticoagulato, oppure di sangue capillare, viene miscelato con una soluzione in un recipiente apposito. Dopo aver lasciato riposare la miscela il tempo necessario, la camera contaglobuli viene riempita. Vantaggi e svantaggi sul conteggio di camera Vantaggi Svantaggi Manegevolità Precisione - analisi semplice da eseguire in ambulatorio - l’ unico apparecchio necessario è il microscopio - nell’ effettuare il conteggio si possono manifestare molti errori e molte imprecisioni - microscopia: il giudizio sugl’ elementi trovati nella camera (dipende dall’ impressione dell’ osservatore) sottostà alle influenze soggettive dell’ osservatore Uso - veloce esaminazione del numero di cellule - inadeguato per il conteggio di cellule in ambito patologico (p.e. leucemia, chemioterapia) I risultati ottenuti con questo metodo possono variare del 10% - per controlli di decorso si consiglia dunque l’uso costante dello stesso metodo. Usare sangue capillare solo in casi eccezionali, datosi che può aumentare la probabilità di errori. Se possibile usare sempre sangue venoso anticoagulato (EDTA). Materiale Materiale d’ uso Provetta di reazione da 2,2 ml Filtro di carta rotondo Æ 60mm Pipette micro (capillari vetro), 10 μl + 50 μl* Pipette micro (capillari vetro), 20 μl* *incl. portapipetta altro - No. Art. confezione M246 M247 M244 M245 da 200 da 100 da 250 da 250 Reattivi Leucociti: Soluzione Türk Eritrociti: Soluzione Dacie & Lewis Trombociti: Soluzione Plaxan No. Art. Bottiglia per test M241 M242 M243 30 ml 30 ml 30 ml 75 (30)* 15 75 (30)* *dipende dalla quantità di soluzione (a o b) vedi tabella sul retropagina (“Schema di pipettata e conteggio “) I clienti del laboratorio team w ag hanno la possibilità di ordinare gli articoli con la caratteristica M direttamente attraverso il laboratorio -> vedi modulo richiesta di materiale labor team w ag Pipettatrice monocanale da 100-1000μl per reattivi Pipettatrice monocanale da 10-100 μl per sangue, alternativa: pipette micro (capillari vetro) 20 μl/ 50 μl/ 10 μl Camera di conteggio Neubauer improved e vetrino copri-oggetto Imbuto e filtro di carta per filtrare la soluzione Metodica EDTA 1 Filtrare soluzione colorante. 1 volta a settimana oppure prima di uso. 2 Prelevare la soluzione colorata e versarla nel recipiente apposito. capillare 3 Prelevare con pipetta il sangue EDTA, oppure con capillare direttamente dal dito. EDTA capillare 4 Pulire il puntale o capillare con batuffolo. Versare il sangue nella soluzione e diluire. * *Per vuotare e pulire il capillare, usare l’ imboccatura che va appoggiata sopra il capillare (dopo il prelievo di sangue). Per tirare su ed emettere/eliminare di nuovo la miscela, tenere chiusa l’ apertura con il dito indice. EDTA 5 Chiudere il cappellino del recipiente e capovolgere. Posare per 5 minute sul miscelatore. (Trombo.: aspettare 5 minuti, e poi posare per 5 minuti sul miscelatore) 6 Agitare il recipiente.Prelevare ca. 20 μl di soluzione e riempire la camera contaglobuli (non riempire troppo e senza bolle d’aria) 7 Sedimentazione in camera cont.: - leucociti/ eritrociti 2 min. - trombociti 15 min.* *camera umida M098-I Schema di pipettata e conteggio Parametro Reattivi Diluzione Leucociti Türk 1:20 Eritrociti Dacie + Lewis 1:200 Trombociti Plaxan 1:20 Variante Sangue in μl Soluzione in μl a) 20 380 b) 50 950 10 1990 a) 20 380 b) 50 950 Per campo di Cellule contate x Fattore norma Conteggio normale x 0.05 = G/l x 50 lc/μl 4 quadrati esterni normale x 0.01 = T/l x 10'000 ec/μl 4 linee (mezzo) normale x1 = G/l x 1’000 tc/μl 4 linee (mezzo) altri volumi di pipetta oppure di diluzione Leucociti „ Türk 1:100 20 1980 lc > 50.0 G/L x 0.25 = G/l x 250 lc/μl 4 quadrati esterni „ 1:10 20 180 lc < 4.0 G/L x 0.025 = G/l x 25 lc/μl 4 quadrati esterni Eritrociti Dacie & Lewis 1:100 20 1980 ec < 3.0 T/L x 0.005 = T/l x 5'000 ec/μl 4 linee (mezzo) Trombociti Plaxan 1:100 20 1980 tc > 450 G/L x5 = G/l x 5’000 tc/μl 4 linee (mezzo) „ 1:10 20 180 tc < 100 G/L x 0.5 = G/l x 500 tc/μl 4 linee (mezzo) „ Conteggio Come? Dove? Fattori che influenzano (riguardanti i pazienti) il conteggio Conteggio di leucociti Eritrociti in fase prematura contenenti dei semi (Eritroblasti basofili) vengono scambiati facilmente per lc , quindi contandoli portano a valori alti, errati->conteggio alto. Conteggio di eritrociti Agglutinine a freddo: anticorpi specifici che provocano l’agglutinazione degli eritrociti. L’agglutinazione porta errori -> conteggio basso. Leucociti – 4 quadrati contare Conteggio di trombociti Aggregazione di trombociti: errori nel prelievo del sangue; non viene miscelata bene la provetta (EDTA), oppure raramente si verifica un’intolleranza all’EDTA da parte del paziente. L’aggregamento porta errori -> conteggio basso. non contare Eritrociti/ Trombociti 4 linee (80 quadratini) Assicurarsi la qualità - Svolgere ogni prova doppiamente - La differenza tra le due prove dovrebbe essere < 10% . Calcolo vedi -> vedi grafica 1 - Partecipare regolarmente alla prova di qualità di laboratorio esterno (paragone diretto con altri ambulatori che usano il conteggio di camera) - Rispettare numero minimo di cellule da contare (tenere bassa la variazione del coefficiente il più possibile) -> vedi grafica 2 ( SA - SB ) x 100 SA = distanza in % - ec almeno 400 cellule (variazione del coefficiente 5%) - lc almeno 100 cellule (variazione del coefficiente 10%) - tc almeno 100 cellule (variazione del coefficiente 10%) SA = Somma più alta / SB = Somma più bassa graf. 1 graf. 2 Fonti d’errore Valori errati Causa tendenza á / â á Se il puntale/capillare non viene pulito si possono verificare errori per via della quantità di sangue in più nella diluzione. á Assorbire il liquido in eccesso nella camera con un batuffolo o carta provoca un dislivello nel rapporto soluzione-cellule. á Camera non sufficientemente detersa (resti di polvere, ecc. possono sembrare Trombociti). á Il copri-ogetti non è applicato correttamente (mancanza dei cerchi di Newton). á Il liquido nella camera inizia ad essiccare (i bordi del liquido si riavvicinano). á oppureâ Prelevamento di sangue/soluzione con puntale/capillare non è stato eseguito correttamente (bolle d’aria, ecc…). á oppure â Miscelazione incorretta della prova. á oppure â Il liquido nella camera di conteggio trabocca. á oppure â Fattore di calcolo incorretto. Come evitare Pulire il puntale/capillare con batuffolo. Attenzione a non aspirare sangue. Riempire la camera in quantità giusta in modo pulito e veloce Detergere la camera correttamente, ripassare con alcool 70% e asciugare con Kleenex. La profondità della camera non corrisponde al volume. Appena si nota un ’essiccamento di liquido, è necessario riempire la camera di nuovo. Dopo la pipettata controllare bene che il puntale/capillare sia ben riempito. Miscelare bene il recipiente. Volume falso = valore falso Vedi „schema di pipettata e calcolo“ sopra.